吳志煥，曹曉涵，曹丹丹

（1.河北工程技術(shù)學(xué)院，石家莊 050091；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川雅安 625014；3.河北醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院/河北省環(huán)境與人群健康重點實驗室，石家莊 050017）

高脂血癥是指脂代謝方面的多種問題[1]，包括膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的升高等。研究降血脂藥物首先要有高脂血癥的動物模型，目前此類模型的動物主要有鼠類、兔、豬等動物，鼠類是最常用的動物模型。昆明小鼠作為基礎(chǔ)實驗的常用動物，具有操作簡便，飼養(yǎng)方便，尤其具有生長發(fā)育較快，代謝旺盛等優(yōu)點。因此，為了更好地研究群體對脂類代謝的特點，本文擬用昆明小鼠，通過高脂飼料的喂養(yǎng)[2]，建立小鼠的高血脂模型；用該高脂模型小鼠作為實驗動物，研究降血脂藥物三七丹參片對小鼠血脂水平的影響，以期為三七丹參片的進一步應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

昆明小鼠80只（雌雄各半，體重20 g左右），購于河北醫(yī)科大學(xué)動物中心，購買后常規(guī)飼養(yǎng)一周，期間自由飲水，監(jiān)測健康狀況。按照下述方法分組和處理。

建立高脂模型組小鼠：選取20只昆明小鼠（雌雄各半），隨機分為 2組（n=10），記為正常組和高脂組，并對各組小鼠稱重記錄。

三七丹參片降脂組小鼠：選取60只昆明小鼠（雌雄各半）。隨機分為6組（n=10），記為空白對照組，高脂模型組，陽性對照組（辛伐他汀組），三七丹參片低、中、高劑量組，并對各組小鼠稱重記錄。

1.2 藥品和試劑

辛伐他汀片及三七丹參片：購于常規(guī)藥店，研缽內(nèi)研磨成粉狀備用。

血糖（GLU）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）檢測試劑盒均購于Beckman Coulter，Inc.公司，糖化血清蛋白（GSP）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所有限公司。其他檢測試劑均為分析純。

飼料購于北京科澳協(xié)力飼料有限公司。配方：基礎(chǔ)飼料為23.07%蛋白質(zhì)+11.85%脂肪+65.08%碳水化合物；高脂飼料為基礎(chǔ)飼料+15%豬油+20%蔗糖+1.2%膽固醇+0.2%膽酸鈉。

1.3 儀器設(shè)備

超凈工作臺，全自動高壓蒸汽滅菌鍋，超速冷凍高速離心機，全自動生化分析儀，移液器等。

1.4 高脂模型小鼠建立

20只昆明小鼠，適應(yīng)性飼喂1周，隨機分為正常組和高脂組（n=10）。正常組飼喂基礎(chǔ)飼料，高脂組飼喂高脂飼料，均為4～6 g/d只，自由飲水。連續(xù)飼喂30 d。每5天稱重并記錄體重。

1.5 降脂組小鼠處理

陽性對照組小鼠體灌胃0.01 g/（kg·d）辛伐他汀，低、中、高劑量組分別灌喂0.5、1.0、2.0 g/（kg·d）三七丹參片，高脂模型組和空白對照組以相同方法灌胃等體積生理鹽水。連續(xù)灌胃30 d，每天稱重1次，末次灌喂前16 h停食停水，末次灌喂1 h后即眼眶靜脈采血。后頸椎脫臼法處死小鼠，取肝組織，稱重記錄后分為兩份，1份甲醛固定，1份凍存于液氮，備用。

1.6 體重測定

動物適應(yīng)性飼喂一周后稱取各鼠體重。試驗期間每5日飼喂前進行稱重。試驗結(jié)束前一天禁食禁水 12 h 以上稱取體重。根據(jù) 0、5、10、15、20、25、30 d的體重，統(tǒng)計各組小鼠體重的增重情況，計算增重率，增重率=（終末平均體重-初始平均體重）/初始平均體重×100%。

1.7 血清處理及血脂指標(biāo)測定

各組采血后血樣室溫放置 1 h后4℃冰箱過夜，3 000 r/min離心15 min，分離上層血清，-20℃保存，測各項指標(biāo)。

按試劑盒說明書測定 TC、TG、LDL-C、HDL-C、GLU和GSP等6項指標(biāo)。

1.8 組織采集和HE染色

各組小鼠脫頸處死后，迅速分離肝組織，稱重，計算肝臟系數(shù)，肝臟系數(shù)=肝臟重/體重×100%。采集部分肝組織經(jīng)4%多聚甲醛組織固定液進行固定。固定組織經(jīng)HE染色分析其病理。

1.9 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS20.0軟件處理。數(shù)據(jù)使用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。數(shù)據(jù)結(jié)果使用單因素方差分析，組間差異使用LSD法比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重

從 0、5、10、15、20、25 和 30 d 統(tǒng)計的體重數(shù)據(jù)分析，從第5天開始高脂組的體重就明顯高于正常組，增長速度明顯快于正常組，30 d試驗結(jié)束時，高脂組小鼠體重比正常組平均重約3 g，其增重率高于正常組約12%。從第5天開始兩組體重的增重率已經(jīng)有顯著差異（P20.01）。試驗結(jié)果見表1。

表1 昆明小鼠體重增重結(jié)果統(tǒng)計（±S，n=10）Table 1 Weight changes of Kunming mice(±S，n=10)g

2.2 肝重及肝臟組織觀察結(jié)果

試驗結(jié)束取肝組織稱重發(fā)現(xiàn)，正常組的肝重為（1.11±0.08）g，高脂組的肝重為（1.38±0.11）g，極顯著高于正常組（P20.01）。肉眼觀察肝臟組織，高脂組的肝臟體積明顯增大，顏色泛黃，呈現(xiàn)出明顯的脂肪肝病變（圖1）；肝組織切片HE染色顯微觀察發(fā)現(xiàn)：正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞整齊排列，未見明顯形態(tài)學(xué)變化；高脂組肝臟組織的結(jié)構(gòu)明顯病變，肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝細胞內(nèi)具有大小不等的圓形空泡（脂肪滴）。中央靜脈和小葉間靜脈還出現(xiàn)了少量紅細胞（圖2）。

圖1 肝臟外觀圖Figure 1 Liver appearance

圖2 HE染色肝組織圖（1 600×1 200）Figure 2 Liver tissue stained with HE（1 600×1 200）

2.3 小鼠血脂水平的化學(xué)檢測

通過生化分析測得高脂組血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）分別為正常組的 1.7倍、1.4倍、1.5倍，差異極顯著（P20.01），但高密度脂蛋白（HDL-C）濃度高脂組與正常組無顯著差異（P30.05）（表 2）。

表2 昆明小鼠血清血脂相關(guān)指標(biāo)（±S，n=10）Table 2 Indexes of serum lipids in Kunming mice（±S，n=10）mmol·L-1

以上試驗結(jié)果表明，高血脂小鼠模型建造成功，可用于后續(xù)試驗。

2.4 三七丹參片對小鼠體重的影響

對正常小鼠和高脂小鼠進行不同種類和劑量的藥品灌胃后，稱量體重，結(jié)果如圖3所示。根據(jù)結(jié)果可以看出，每組小鼠均有一定的體重增長，正常組、高脂組、陽性組以及三七丹參片高、中、低劑量組增重分別為 6.11、9.45、6.38、7.08、7.6 和 8.64 g。其中增重最低的是正常組，增重最多的是高脂組，符合試驗預(yù)期。而服用了三七丹參片后，各組小鼠體重增加有所減少，其中高劑量組增重的減少最明顯，最靠近陽性對照（即辛伐他汀片）。說明三七丹參片有良好的控制體重的效果。

2.5 三七丹參片對小鼠肝臟重的影響

對正常小鼠和高脂小鼠進行不同種類和劑量的藥品灌胃后，處死后稱量肝臟重和體重，計算肝臟系數(shù)，結(jié)果如圖4所示。根據(jù)結(jié)果可以看出，服用了三七丹參片后，肝臟系數(shù)均有所降低，雖然差異不顯著（P30.05），但其中高劑量組有明顯的降低趨勢。說明三七丹參片有良好的控制肝重的效果。

圖4 三七丹參片對小鼠肝臟系數(shù)的影響Figure 4 Effect of Sanqi Danshen Tablet on liver coefficient of Kunming mice

2.6 三七丹參片對小鼠血液指標(biāo)的影響

2.6.1 三七丹參片對小鼠血脂的影響

對正常小鼠和高脂小鼠進行不同種類和劑量的藥品灌胃后，斷頸處死立即采血，分離血清，按照試劑盒說明檢測血清中血脂相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果如圖5a～圖5d所示。根據(jù)結(jié)果可以看出，服用了三七丹參片后，高劑量組的血脂指標(biāo)有所降低，說明三七丹參片起到了良好的降血脂的效果。

圖5 三七丹參片對小鼠血清血脂的影響Figure 5 Effect of Sanqi Danshen Tablet on serum lipid in mice

2.6.2 三七丹參片對小鼠血糖的影響

對正常小鼠和高脂小鼠進行不同種類和劑量的藥品灌胃后，斷頸處死立即采血，分離血清，按照試劑盒說明檢測血清中血糖和糖化血清蛋白2項指標(biāo)。結(jié)果如圖6所示。根據(jù)結(jié)果可以看出，服用了三七丹參片后，高劑量組的2項血糖相關(guān)指標(biāo)有降低，說明三七丹參片起到了良好的降血糖的效果。

圖6 三七丹參片對小鼠血清血糖的影響Figure 6 Effect of Sanqi Danshen Tablet on serum glucose in mice

3 討論

建立良好的高血脂模型對高脂血癥以及降血脂藥物的研究具有重要的意義。目前，常用的有基因缺陷型模型動物、注射或者高脂飼料飼喂等方法，以大鼠、小鼠和兔等動物為研究對象來建立高脂模型?；蛉毕菪头椒ㄔ靸r較高，注射方法動物較難長時間耐受，所以本研究選擇操作簡單的高脂飼料飼喂方法，并選取代謝水平較高、生長發(fā)育較快、易操作的昆明小鼠作為研究對象。

研究結(jié)果分析表明20只昆明小鼠均能很好地耐受高脂飲食，試驗過程并沒有拒食現(xiàn)象的出現(xiàn)。從飼喂第5天開始，高脂組與正常組體重就出現(xiàn)明顯差異，其體重增長速度明顯快于正常組，說明小鼠對高脂飼料的代謝與吸收具有良好的效果。30 d試驗結(jié)束時，高脂組小鼠體重比正常組重約4 g，其增重率高于正常組約12%，這也符合高脂血癥體重增加的特點，且經(jīng)分析均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P20.01）。試驗結(jié)束稱得肝重，結(jié)果顯示高脂組的肝重明顯高于正常組（P20.01），且肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，高脂組的肝臟體積明顯增大，顏色泛黃，預(yù)示脂肪肝病變的出現(xiàn)，同時表明已初步成功建立了小鼠高脂模型。肝組織切片HE染色顯微觀察顯示高脂組肝臟組織的肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝細胞內(nèi)具有大小不等的脂肪滴出現(xiàn)，中央靜脈和小葉間靜脈還出現(xiàn)了少量紅細胞，充分表明高脂組肝臟組織結(jié)構(gòu)明顯病變，進一步驗證高脂飼料喂養(yǎng)成功建立了高脂模型[3-4]。小鼠血清血脂的檢測結(jié)果表明高脂組血清TC、TG和LDL-C等血脂指標(biāo)均明顯高于正常組（P20.01），說明本研究形成了預(yù)期的高血脂模型。

綜上研究結(jié)果表明，通過給昆明小鼠飼喂30 d高脂飼料，成功建立了小鼠高脂模型，該模型與人類高脂血癥癥狀極為相似，可為后續(xù)高脂血癥臨床藥理的研究提供很好的實驗?zāi)Ｐ蚚5]。

肝臟是脂質(zhì)代謝的重要器官。研究證明，隨著高脂飲食的喂養(yǎng)，小鼠的體重及肝重均會呈現(xiàn)高于正常組的趨勢。觀察三七丹參片干預(yù)是否可以改善高脂飲食帶來的體重及肝重的增加。另外，以辛伐他汀為陽性對照，進行效果比對[6]。給藥結(jié)束后，考察各組小鼠血脂（總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇）和血糖（糖化血清蛋白、葡萄糖）等指標(biāo)[7-9]，觀察三七丹參片干預(yù)對高脂小鼠血脂、血糖[9-10]的影響。本研究結(jié)果顯示，三七丹參片對高脂食物造成的高血脂小鼠有很好的降血脂和降血糖作用。近年來，中草藥綜合調(diào)節(jié)血脂、血糖的優(yōu)勢，已成為降脂藥物研究的主要方向[5]。三七丹參片除了增強免疫功能等療效外[11]，本研究結(jié)果也為它在治療高脂血癥的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。