姜紅巖，范希峰，溫海峰，韓 朝，滕文軍，滕 珂，尹淑霞

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院，北京 100097；2.北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，北京 100083）

土壤鹽堿化是影響植物生長(zhǎng)的主要非生物脅迫，嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量[1]。鹽脅迫會(huì)使植物產(chǎn)生離子毒害作用，影響植物吸收水分，破壞生理機(jī)制導(dǎo)致植物枯萎死亡[1-2]。草坪草生長(zhǎng)容易受到外界環(huán)境的影響，坪觀質(zhì)量在園林綠化、運(yùn)動(dòng)場(chǎng)應(yīng)用中是一項(xiàng)重要的衡量標(biāo)準(zhǔn)。鹽脅迫影響草坪草種子的萌發(fā)，草坪草的生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累及抗氧化酶的活性，從而影響草坪的使用價(jià)值[3-4]。

轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抵抗環(huán)境脅迫中發(fā)揮著重要作用[5]。已有研究證明，轉(zhuǎn)錄因子能夠通過(guò)調(diào)控上下游基因影響植物對(duì)鹽脅迫的耐受性，其中包括AP2/ERF、NAC、WRKY、MYC 等轉(zhuǎn)錄因子家族[5]。NAC 轉(zhuǎn)錄因子在模式植物中被率先得以研究，發(fā)現(xiàn)其在鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[6]。NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族成員在調(diào)控鹽脅迫中具有不同的功能，有些NAC 轉(zhuǎn)錄因子在植物的抗鹽性方面起負(fù)調(diào)控作用，而另一些成員發(fā)揮著正調(diào)控的作用。如NAC 轉(zhuǎn)錄因子NTL8能夠通過(guò)赤霉素(gibberellin acid，GA)信號(hào)傳導(dǎo)途徑負(fù)調(diào)節(jié)種子的發(fā)芽[7]；過(guò)表達(dá)ANAC092基因能降低鹽脅迫下種子的發(fā)芽能力[8]。而PvNAC1[9]、SNAC1[10]、ONAC045[11]、OsNAC2[12]、OsNAC6[13]等轉(zhuǎn)錄因子能夠增強(qiáng)植物的耐鹽性。

結(jié)縷草(Zoysia japonica)是我國(guó)一種重要的鄉(xiāng)土草坪草，具有抗逆性強(qiáng)、養(yǎng)護(hù)成本低等優(yōu)點(diǎn)[14]。在結(jié)縷草中鮮有NAC 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物的耐鹽性影響的報(bào)道，之前研究表明日本結(jié)縷草中的ZjNAC2基因能夠受到300 mmol·L?1NaCl 的誘導(dǎo)表達(dá)[15]，而NAC 轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)縷草適應(yīng)鹽脅迫中的作用尚不清楚。本研究通過(guò)獲得轉(zhuǎn)ZjNAC3基因的酵母菌株和擬南芥(Arabidopsis thaliana)植株，并對(duì)其進(jìn)行鹽脅迫處理，旨在探究日本結(jié)縷草NAC 轉(zhuǎn)錄因子ZjNAC3 在鹽脅迫下的調(diào)控作用，以期為深入研究NAC 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控日本結(jié)縷草耐鹽性及其機(jī)理奠定前期工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

農(nóng)桿菌GV3101、擬南芥種子、pYES2 載體、YPH500 酵母菌株均為北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所實(shí)驗(yàn)室保存；Ura 培養(yǎng)基購(gòu)自北京泛基諾公司；氯化鈉等分析純?cè)噭┵?gòu)自北京科百奧公司；RNA 試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA 公司；SYBR Premix購(gòu)自TaKaRa 公司。本試驗(yàn)所用擬南芥植株在江南人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為24 ℃/22 ℃ (日/夜)，16 h 光照，濕度65%。

1.2 方法

1.2.1 酵母轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因酵母的鹽脅迫處理

以pYES2-ZjNAC3-F/R 為 引 物(表1)，pMD19-ZjNAC3 克隆載體為模板擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pYES2 載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒pYES2-ZjNAC3。按照Clontech 的說(shuō)明書(shū)(貨號(hào)： 630439) 轉(zhuǎn)化酵母，分別將構(gòu)建的pYES2-ZjNAC3 和pYES2 空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化YPH500 酵母菌株。挑取SD/-Ura 培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的單菌落于Ura 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值為0.2，以pYES2-F/R (表1)為引物進(jìn)行菌落PCR 鑒定后，按照 1 ? 10、1 ? 100、1 ? 1 000、1 ? 10 000 的比例進(jìn)行稀釋。將稀釋后的菌液接種到含有0、200、300 mmol·L?1NaCl 的Ura 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3 d，觀察酵母菌落的生長(zhǎng)情況。

1.2.2 擬南芥轉(zhuǎn)基因

以3302Y3-ZjNAC3-F/R 為引物(表1)，以pMD19-ZjNAC3 克隆載體為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到3302Y3 載體[15]上，構(gòu)建3302Y3-ZjNAC3。取5 μL 構(gòu)建好的質(zhì)粒于50 μL 農(nóng)桿菌感受態(tài)中，冰浴30 min，液氮中速凍1 min，37 ℃下水浴5 min，冰浴5 min，之后28 ℃暗培養(yǎng)4 h 后涂布于培養(yǎng)基上培養(yǎng)，2～3 d 后挑取單克隆進(jìn)行PCR 鑒定。對(duì)鑒定正確的菌液用50%甘油進(jìn)行保菌，于?80 ℃冰箱保存以備用。然后用獲得的轉(zhuǎn)化目的質(zhì)粒的GV3101農(nóng)桿菌菌液浸染擬南芥花序，選擇生長(zhǎng)3～4 周大小的擬南芥植株，將其花序浸到農(nóng)桿菌菌液中，浸染時(shí)間不超過(guò)30 s，暗培養(yǎng)12 h 后恢復(fù)正常的光照條件。待植株生長(zhǎng)成熟后收獲的種子備用。

表1 引物列表Table 1 List of primers used in this study

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

將收獲的T0代擬南芥種子放于冰箱中4 ℃下春化2～3 d，播種于草炭 ? 蛭石 ? 珍珠巖配比為3 ? 1 ? 1的基質(zhì)中。播種后1～2 周，對(duì)幼苗噴施60 mg·L?1的草銨膦溶液一次進(jìn)行初步篩選。存活下來(lái)的擬南芥植株生長(zhǎng)至3～4 周后，用CTAB 法提取葉片DNA，并以3302Y3-F/R (表1) 為引物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株鑒定。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后，選擇條帶大小符合的擬南芥植株繼續(xù)收獲種子，直至篩選至T3代后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的鹽脅迫處理

選用穩(wěn)定遺傳的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，先用1%次氯酸鈉溶液消毒5 min，70%酒精消毒30 s，無(wú)菌水清洗4～5 次，然后播種在MS 培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)3 周后轉(zhuǎn)移到基質(zhì)中生長(zhǎng)。待植株生長(zhǎng)1 個(gè)月時(shí)，提取整株轉(zhuǎn)基因擬南芥的RNA，以ZjNAC3-F/R 為引物(表1)對(duì)ZjNAC3進(jìn)行表達(dá)量分析。選擇ZjNAC3基因表達(dá)量相對(duì)較高的株系和野生型(WT)進(jìn)行鹽脅迫處理，每個(gè)株系設(shè)置4 個(gè)重復(fù)。每盆第1 天澆灌50 mL 50 mmol·L?1的NaCl，第2天澆灌50 mL 100 mmol·L?1NaCl，第3 天澆灌50 mL 150 mmol·L?1NaCl，對(duì)照澆灌相同量的蒸餾水，處理7 d后拍照并剪取葉片測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

采用蒽酮顯色法[16]、茚三酮比色法[16]、浸提法[17]、硫代巴比妥酸(TBA)比色法[18]分別測(cè)定可溶性糖、脯氨酸、葉綠素、丙二醛含量，同時(shí)參照陳愛(ài)葵等[19]的方法測(cè)定細(xì)胞膜透性。利用RNA 試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過(guò)qRT-PCR 技術(shù)，以AtUBQ 為內(nèi)參，參照Teng 等[14]設(shè) 計(jì)AtNHX1、AtAPX1、AtPOD 和AtUBQ 引 物(表1)，采 用2?ΔΔCT法測(cè)定AtNHX1、AtAPX1、AtPOD基因的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZjNAC3 基因?qū)}脅迫下酵母菌株生長(zhǎng)的影響

本研究成功構(gòu)建了載體pYES2-ZjNAC3 (圖1)，同時(shí)將pYES2-ZjNAC3 載體轉(zhuǎn)到酵母YPH500 菌株中進(jìn)行鹽敏感性測(cè)定(圖2)。

圖1 pYES2-ZjNAC3 載體構(gòu)建的PCR 檢測(cè)Figure 1 PCR verification of the constructed pYES2-ZjNAC3 vector

圖2 ZjNAC3 對(duì)轉(zhuǎn)基因酵母的影響Figure 2 Effect of ZjNAC3 on the growth of transgenic yeast cells under salt stress

結(jié)果表明，在Ura 固體培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)空載與重組質(zhì)粒pYES2-ZjNAC3 的酵母菌株在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)長(zhǎng)勢(shì)基本一致。而在鹽脅迫下，含有重組質(zhì)粒的酵母菌株在濃度稀釋104倍后其長(zhǎng)勢(shì)明顯弱于對(duì)照；同時(shí)，隨著Ura 固體培養(yǎng)基上鹽濃度的增加，酵母菌株的長(zhǎng)勢(shì)呈逐漸減弱的趨勢(shì)。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的獲取

噴施草銨膦后，大部分T1代植株幼苗枯萎死亡，只有少部分幼苗存活下來(lái)(圖3)。對(duì)存活的植株提取DNA，通過(guò)PCR 檢測(cè)進(jìn)一步篩選抗性植株，將含有目的基因條帶的擬南芥株系繼續(xù)篩選培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定遺傳的T3代植株(圖4)。

圖3 草銨膦篩選后的抗性植株Figure 3 Screening of transgenic plants using glufosinate

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥T3 代植株Figure 4 Transgenic Arabidopsis thaliana (T3 generation)

2.3 鹽脅迫下過(guò)表達(dá)ZjNAC3 基因擬南芥的形態(tài)變化

對(duì)過(guò)表達(dá)ZjNAC3基因的擬南芥株系中的ZjNAC3基因進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)在這些轉(zhuǎn)基因株系中均有ZjNAC3基因的表達(dá)，且表達(dá)水平不一致，本研究中選用了基因表達(dá)量相對(duì)較高的40#和57#兩個(gè)株系進(jìn)行鹽脅迫處理(圖5)。

圖5 轉(zhuǎn)基因株系T3 代中ZjNAC3 基因的表達(dá)水平Figure 5 Expression levels of the ZjNAC3 gene in the transgenic T3 Arabidopsis lines

為了進(jìn)一步探究ZjNAC3基因是否參與鹽脅迫響應(yīng)，對(duì)過(guò)表達(dá)擬南芥進(jìn)行鹽敏感性測(cè)定(圖6)，可以看出，鹽處理第7 天對(duì)照處理中WT 與轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致，處理組中WT 的生長(zhǎng)狀態(tài)明顯好于轉(zhuǎn)基因株系，這體現(xiàn)在WT 葉片顏色更深，覆蓋度更高。相比之下，轉(zhuǎn)基因株系中葉片明顯黃化，尤其是40#株系。

圖6 150 mmol·L?1 NaCl 處理后轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的表型Figure 6 Phenotype of transgenic Arabidopsis thaliana lines grown in the presence of 150 mmol·L?1 NaCl

2.4 鹽脅迫下過(guò)表達(dá)ZjNAC3 基因擬南芥的生理響應(yīng)

鹽脅迫處理后轉(zhuǎn)基因擬南芥與對(duì)照相比，生理指標(biāo)發(fā)生了明顯變化(圖7)。在鹽處理7 d 后，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中的脯氨酸含量、丙二醛含量、電解質(zhì)滲透率顯著高于WT (P< 0.05)，表明在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系受到的傷害程度更高；而可溶性糖含量、葉綠素含量顯著低于WT (P< 0.05)，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因株系在鹽脅迫下的葉綠素積累和滲透調(diào)節(jié)的能力受到了明顯抑制。

圖7 150 mmol·L?1 NaCl 處理7 d 后轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的生理變化Figure 7 Changes in the physiological indexes of transgenic Arabidopsis thaliana treated with 150 mmol·L?1 NaCl over a 7-day period

2.5 抗性基因的表達(dá)分析

鹽脅迫處理后，WT 中AtAPX1、AtPOD基因的表達(dá)水平無(wú)顯著變化，而AtNHX1基因的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照(P< 0.05)，約為對(duì)照的1.5 倍；轉(zhuǎn)基因植株中AtNHX1、AtAPX1基因的表達(dá)水平在鹽處理后分別低于對(duì)照1.5 倍和2 倍，AtPOD基因的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照4 倍(P< 0.05) (圖8)。

圖8 150 mmol·L?1 NaCl 處理后抗性基因的表達(dá)分析情況Figure 8 Expression of other salt resistance genes following treatment with 150 mmol·L?1 NaCl

3 討論

NAC 轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物鹽脅迫響應(yīng)方面已有廣泛研究，其在鹽脅迫調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本研究探究了ZjNAC3對(duì)酵母YPH500 菌株的鹽敏感性，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)ZjNAC3的酵母細(xì)胞在鹽脅迫下長(zhǎng)勢(shì)弱于對(duì)照，表明在鹽脅迫下ZjNAC3對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用。

為進(jìn)一步探究ZjNAC3基因?qū)M南芥植株耐鹽性的影響，本研究通過(guò)農(nóng)桿菌侵染擬南芥的方法獲得了轉(zhuǎn)ZjNAC3基因擬南芥植株，并進(jìn)行鹽脅迫處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽處理后轉(zhuǎn)基因植株中的葉綠素含量均顯著低于WT。葉綠素是植物光合作用所必需的色素，其含量降低影響植物的光合效率[20-21]，推測(cè)轉(zhuǎn)ZjNAC3基因植株的光合作用受到鹽脅迫的明顯抑制。可溶性糖既是植物光合作用的產(chǎn)物[22]，也常被作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[23]。本研究中，鹽處理后，對(duì)照的可溶性糖含量顯著高于過(guò)表達(dá)株系，說(shuō)明對(duì)照的滲透調(diào)節(jié)能力強(qiáng)于過(guò)表達(dá)株系。因此，滲透調(diào)節(jié)方面反映出過(guò)表達(dá)ZjNAC3基因植株的耐鹽性比WT 弱。

脯氨酸常被視為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，是判斷抗逆性的一種指標(biāo)[24]。而近年來(lái)脯氨酸在植物抗逆中的作用存在一定爭(zhēng)議，如Yuan 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Osa-miR396c的匍匐剪股穎(Agrostis stolonifera)的耐鹽性顯著提高，然而測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系中的脯氨酸含量顯著低于WT，這可能是脯氨酸的穩(wěn)態(tài)比脯氨酸的積累對(duì)脅迫下植物的生長(zhǎng)發(fā)育更重要。也有研究認(rèn)為脯氨酸的含量是植物在脅迫條件下受損程度的一種指標(biāo)，例如鹽敏感品種的水稻(Oryza sativa)在鹽脅迫下脯氨酸含量高于耐鹽品種，但其滲透調(diào)節(jié)能力較低[26]。本研究認(rèn)為，脯氨酸是衡量脅迫受損的指標(biāo)之一。鹽處理后轉(zhuǎn)基因植株中脯氨酸含量顯著高于WT，轉(zhuǎn)基因植株的受損程度高于WT。丙二醛含量和細(xì)胞膜透性也是衡量植

株受損程度的指標(biāo)，鹽脅迫條件下植物內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，細(xì)胞膜膜脂被氧化產(chǎn)生大量丙二醛；細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)、有機(jī)物等外泄[27-30]。本研究發(fā)現(xiàn)在鹽處理后，過(guò)細(xì)胞膜透性和丙二醛的含量在過(guò)表達(dá)株系中明顯比WT 高，說(shuō)明過(guò)表達(dá)株系的損傷更強(qiáng)。anac092-1突變體耐鹽性的研究結(jié)果與本研究的結(jié)果一致：鹽脅迫既增強(qiáng)了突變體種子的發(fā)芽能力，同時(shí)又抑制了葉片衰老；而對(duì)于過(guò)表達(dá)株系中，鹽脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了阻礙[8]。

過(guò)表達(dá)柳枝稷(Panicum virgatum)PvNAC1增強(qiáng)了芽和根中K+的積累，而抑制了Na+的積累，并誘導(dǎo)相關(guān)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)[9]。AtNHX1基因編碼液泡逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以將細(xì)胞液中的Na+隔離到液泡中，與植物抗性密切相關(guān)[31]。本研究中，在鹽脅迫處理后，AtNHX1基因的表達(dá)水平在轉(zhuǎn)基因植株中顯著低于WT，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株將Na+隔離到液泡中的能力弱于WT，這與Apse 等[31]和Zhang 等[32]的研究結(jié)果一致。AtAPX1和AtPOD基因分別編碼抗壞血栓過(guò)氧化物酶(APX)、過(guò)氧化物酶(POD)，能夠減弱過(guò)量活性氧對(duì)細(xì)胞造成的損傷[33-34]。本研究中，鹽處理后轉(zhuǎn)基因植株中AtAPX1和AtPOD的表達(dá)水平，與WT 相比分別顯著降低和升高，抗氧化酶基因的表達(dá)水平不一致。馬長(zhǎng)樂(lè)等[35]研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下鹽地堿蓬(Suaeda salsa)中SsAPX的表達(dá)量增加；而劉香娥等[36]研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下西瓜(Citrullus lanatus) POD 和APX 的合成受阻。本研究中，鹽脅迫處理與對(duì)照的WT 中AtAPX1和AtPOD基因表達(dá)水平未顯著性變化，表明WT 在經(jīng)歷7 d的150 mmol·L?1NaCl 處理后，體內(nèi)活性氧已到達(dá)穩(wěn)定水平，抗氧化基因的調(diào)節(jié)不明顯。而轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)活性氧發(fā)生明顯的改變，需要激活抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)維持活性氧的平衡，其中的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

為研究日本結(jié)縷草ZjNAC3在鹽脅迫中的功能，首先通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)ZjNAC3基因酵母菌株的鹽敏感測(cè)試，發(fā)現(xiàn)ZjNAC3基因減弱了酵母菌株的耐鹽性。進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)ZjNAC3基因能夠使擬南芥植株的耐鹽性降低。分析發(fā)現(xiàn)ZjNAC3基因可通過(guò)減弱轉(zhuǎn)基因株系的滲透調(diào)節(jié)能力、增加細(xì)胞受損程度、降低將Na+隔離到液泡的功能等途徑參與鹽脅迫調(diào)控途徑。本研究為進(jìn)一步研究結(jié)縷草中NAC 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。