羅小娟，曹 科△，陶明俊，陳小文，張 琴，彭 剛，陳運(yùn)生

(廣東省深圳市兒童醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科;2.兒研所;3.內(nèi)分泌科;4.青春期婦科 518038)

雙酚A(BPA)作為一種環(huán)氧樹脂和聚碳酸酯塑料的重要化工原料，廣泛存在于人類日常生活用品和生存環(huán)境中，并可通過消化道、呼吸道和皮膚等途徑暴露于人類，引發(fā)公共健康和安全問題[1-3]。近年來，女童性早熟發(fā)病率存在明顯上升趨勢，隨著人體血液、尿液等生物標(biāo)本BPA的檢出，其對雌性個(gè)體青春發(fā)育和內(nèi)分泌的干擾作用及對生殖系統(tǒng)的毒性機(jī)制，引起公眾和學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。有研究認(rèn)為BPA通過擬雌激素樣作用，干擾人類內(nèi)分泌系統(tǒng)的平衡和生殖系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能，可能與女童特發(fā)性中樞性性早熟(ICPP)的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[4-6]，但其確切的致病機(jī)制尚未闡明。青春期啟動(dòng)與發(fā)育是遺傳基因與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，新近研究認(rèn)為 BPA暴露可能通過干擾和改變DNA甲基化等基因表觀遺傳學(xué)方式影響生殖系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能[7-10]。下丘腦KISS-1/GPR54基因?qū)Υ傩韵佥S的啟動(dòng)至關(guān)重要，KISS-1基因編碼蛋白kisspeptin通過與受體蛋白GPR54結(jié)合，可刺激GnRH釋放而啟動(dòng)下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA)，且其促性腺激素效應(yīng)的基本位點(diǎn)在下丘腦GnRH神經(jīng)元內(nèi)，且是唯一通過GPR54介導(dǎo)的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。目前，國內(nèi)外先后運(yùn)用各種最新技術(shù)手段對KISS-1/GPR54基因變異和多態(tài)性進(jìn)行檢測分析，結(jié)果表明KISS-1/GPR54基因變異和多態(tài)性并不是導(dǎo)致性早熟的常見原因，提示可能存在環(huán)境因素通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制上調(diào)KISS-1/GPR54基因的表達(dá)，進(jìn)而刺激GnRH釋放啟動(dòng)HPGA導(dǎo)致性早熟。

本研究采用動(dòng)物模型以處于青春啟動(dòng)前關(guān)鍵期的雌性幼鼠(出生21 d)作為研究對象，通過灌胃給予BPA染毒干預(yù)，以17β-雌二醇(E2)組作為陽性對照，同時(shí)設(shè)立溶劑對照組，通過觀察大鼠陰道開口時(shí)間(vaginal opening day,VOD，雌性大鼠性早熟的標(biāo)志)，檢測大鼠卵巢ERα、ERβ mRNA和下丘腦KISS-1、GPR54 mRNA表達(dá)和基因甲基化水平。探討B(tài)PA暴露誘導(dǎo)雌性大鼠性早熟的DNA甲基化分子機(jī)制，對降低人類BPA暴露危害和女童性早熟等疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)和參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

BPA(分析純99%)，美國Sigma公司，玉米油(溶劑)購于益海嘉里投資有限公司，核酸分離純化試劑盒購于廣州洪祥生物醫(yī)藥科技有限公司，熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒購于日本TaKaRa公司，ERα、ERβ、KISS-1、GPR54引物由上海 Invitrogen 公司合成，DNA Methylation-Gold 試劑盒購于美國ZYMO公司，其他生化試劑及耗材等均購于上海生工生物工程股份有限公司。儀器：Localized Performance超低溫冰箱購于美國Thermo Fisher公司，Eppendorf 5418低溫高速離心機(jī)購于德國Eppendorf公司，Millipore-Q A10 超純水儀購于美國Millipore 公司，可見紫外分光光度計(jì)購于日本島津公司，PyroMark Q24 焦磷酸測序儀購于美國Qiagen公司，ABI 7900 HT 熒光定量PCR儀購于美國Life Tech公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立

經(jīng)檢疫合格的清潔級1 d齡SD大鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號：44007200025061，無特定病原體(SPF)級動(dòng)物房飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度、濕度等條件保持穩(wěn)定，12 h光照和黑暗循環(huán)、自由進(jìn)食飲水，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均喂以不含大豆異黃酮等植物雌激素的加工飼料，仔鼠于21 d齡斷乳稱重，留取32只雌性幼鼠，分成4組：BPA干預(yù)組、BPA空白對照組(以等體積不含BPA的玉米油灌胃處理，并與BPA干預(yù)組同時(shí)處死)、E2組(17β-estradiol組，E2組，0.1 mg/kg)和溶劑對照組(以等體積不含BPA的玉米油灌胃處理直至大鼠出現(xiàn)陰道開口再處死)，以大鼠皮膚染色和籠具雙重編號標(biāo)記識別。根據(jù)既往研究報(bào)道[11-12]，BPA干預(yù)濃度設(shè)為每天0.25 mg/kg，在人群日常暴露范圍內(nèi)，每天以灌胃方式持續(xù)給藥10 d，溶劑對照組以相同方式給予等量玉米油。每4天稱重1次，依據(jù)體重調(diào)整藥物劑量。每天檢查并記錄大鼠陰道開口，并于陰道開口當(dāng)天處死，處死BPA干預(yù)組時(shí)按等比例處死BPA空白對照組。留取大鼠下丘腦和卵巢組織置于-80 ℃超低溫冰箱保存待測。本研究由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心批準(zhǔn)，符合動(dòng)物倫理原則，將實(shí)驗(yàn)大鼠傷害降至最低，無虐待動(dòng)物行為。

1.2.2卵巢ERα、ERβ mRNA和下丘腦KISS-1、GPR54 mRNA表達(dá)水平檢測

分別取出30 mg下丘腦和卵巢組織加入1 mL TRIzol充分研磨，按照RNA提取試劑盒說明書提取下丘腦和卵巢組織總RNA，經(jīng)紫外光分光光度計(jì)檢測核酸純度，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)SYBRGreen Real-Time PCR Master Mix試劑盒說明，對下丘腦KISS-1、GPR54和卵巢ERα、ERβ目的基因和管家基因GAPDH分別進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)，real-time PCR反應(yīng)體系： PCR Master Mix 10 μL,正反向引物各1 μL,去離子水6 μL,cDNA 2 μL,共20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s；72 ℃ 30 s，共50個(gè)循環(huán)。72 ℃收集熒光，并行基因表達(dá)水平分析。各基因引物序列見表1。

表1 目的基因和管家基因引物序列

1.2.3卵巢ERα、ERβ和下丘腦KISS-1、GPR54啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平測定

分別取卵巢和下丘腦組織經(jīng)充分研磨，按照DNA提取試劑盒說明書分離純化核酸,將提取的DNA置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和焦磷酸測序PCR：基因組DNA 經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理，序列中未甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)，而甲基化的胞嘧啶保持不變。采用CPGPLOT軟件預(yù)測目的基因CpG島區(qū)域，針對上述基因CpG島設(shè)計(jì)合成特異性引物擴(kuò)增目的區(qū)段，按儀器和試劑說明書進(jìn)行單鏈的分離純化和焦磷酸測序。測定目標(biāo)位點(diǎn)中C/胸腺嘧啶(T)的比率，以此判斷目標(biāo)位點(diǎn)的甲基化程度。目的基因CpG位點(diǎn)甲基化水平(%)=mC/(mC+T),其中mC表示處于甲基化狀態(tài)的CpG位點(diǎn)測序序列條數(shù)，T表示處于非甲基化狀態(tài)的CpG位點(diǎn)測序序列條數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠VOD和體重比較

BPA干預(yù)組和E2組VOD比溶劑對照組顯著提前(P<0.05)，E2組較BPA干預(yù)組更早(P<0.05)；第1次給藥前各組大鼠體重相當(dāng)(P>0.05)，處死時(shí)BPA干預(yù)組、BPA空白對照組和E2組體重顯著低于溶劑對照組(與生存天數(shù)相關(guān)，P<0.05)，BPA干預(yù)組和BPA空白對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠VOD和體重比較

2.2 各組大鼠卵巢ERα、ERβ和下丘腦KISS-1、GPR54基因mRNA表達(dá)情況比較

BPA干預(yù)組下丘腦KISS-1、GPR54 mRNA相對表達(dá)水平顯著高于BPA空白對照組(P<0.05)，但與溶劑對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。E2組卵巢ERβ和下丘腦KISS-1 mRNA相對表達(dá)水平明顯低于溶劑對照組(P<0.05)。E2組和溶劑對照組下丘腦GPR54 mRNA相對表達(dá)水平顯著高于BPA空白對照組(處死時(shí)尚未出現(xiàn)VOD，P<0.05。見表3。

表3 各組大鼠卵巢ERα、ERβ和下丘腦KISS-1、GPR54基因mRNA相對表達(dá)水平比較

2.3 各組大鼠卵巢ERα、ERβ和下丘腦KISS-1、GPR54基因CpG 位點(diǎn)甲基化水平比較

BPA干預(yù)組、BPA空白對照組、E2組和溶劑對照組4組間比較，下丘腦KISS-1基因CpG 位點(diǎn)甲基化水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而GPR54基因CpG 位點(diǎn)甲基化水平存在明顯差異，其中BPA干預(yù)組、E2組和溶劑對照組GPR54片段1 CpG 位點(diǎn)甲基化水平顯著低于BPA空白對照組(處死時(shí)尚未出現(xiàn)VOD，P<0.05)。BPA干預(yù)組GPR54片段2 CpG 位點(diǎn)甲基化水平顯著低于溶劑對照組，而E2組卵巢ERβ基因CpG位點(diǎn)甲基化水平顯著高于溶劑對照組(P<0.05)，其余未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表4。

表4 各組大鼠卵巢ERα、ERβ和下丘腦KISS-1、GPR54基因CpG 位點(diǎn)甲基化水平比較[M(P25,P75)，%，n=8]

2.4 VOD與各目的基因CpG位點(diǎn)甲基化水平的相關(guān)性

經(jīng)秩相關(guān)分析，大鼠VOD與GPR54片段1 CpG位點(diǎn)甲基化水平之間呈正相關(guān)(r=0.245,P=0.009)，其余目的基因CpG位點(diǎn)甲基化水平與VOD之間未見明顯相關(guān)(P>0.05)，見表5。

表5 VOD與各目的基因CpG位點(diǎn)甲基化水平的相關(guān)性

3 討 論

個(gè)體的生長發(fā)育和性成熟過程受基因、環(huán)境、營養(yǎng)和社會(huì)因素等影響[13-14]，近年來，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disrupting chemicals,EDCs)對生殖健康和內(nèi)分泌干擾作用備受關(guān)注。BPA是世界上最高產(chǎn)量的有機(jī)化工原料之一，是一種常見且有代表性的EDCs，具有類雌激素樣內(nèi)分泌干擾作用和生殖毒性。本研究采用玉米油為溶媒，BPA空白對照組采用和BPA干預(yù)組等體積的溶媒灌胃處理，同時(shí)設(shè)立溶劑對照組，旨在最大限度地減少溶媒對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，保證結(jié)論的可信性。研究結(jié)果顯示，BPA干預(yù)染毒可致處于青春啟動(dòng)前關(guān)鍵期的雌性幼鼠VOD提前，與國內(nèi)外研究結(jié)果一致[11,15-17]，提示青春期前BPA暴露可促進(jìn)青春期發(fā)育，導(dǎo)致雌性幼鼠性早熟。但是BPA引起性早熟的劑量效應(yīng)關(guān)系有待進(jìn)一步研究分析。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，EDCs存在“U”效應(yīng)現(xiàn)象，即在一定的劑量范圍內(nèi)，劑量-效應(yīng)曲線的斜率可發(fā)生正負(fù)轉(zhuǎn)換[18]。

近年來，隨著表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究的顯著進(jìn)展，DNA甲基化分子機(jī)制在“青春發(fā)育啟動(dòng)”這個(gè)兼有短期快速和長期緩慢調(diào)節(jié)特點(diǎn)的復(fù)雜生理現(xiàn)象中的調(diào)控作用備受關(guān)注[19-20]。EDCs等環(huán)境因素直接改變靶基因序列并不常見，而是主要通過改變靶基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化、組蛋白修飾和微RNA(micro RNA)介導(dǎo)等表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，啟動(dòng)子區(qū)DNA高甲基化能抑制轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，導(dǎo)致基因表達(dá)抑制或沉默，從而發(fā)揮其毒性和干擾作用。動(dòng)物研究表明，GnRH、ESR1等HPGA相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平改變可能導(dǎo)致青春發(fā)育啟動(dòng)時(shí)間提前[21]；新生小鼠BPA暴露可能通過改變細(xì)胞信號通路重要基因甲基化水平，導(dǎo)致成年后前列腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加；BPA暴露水平與不孕癥婦女外周血DNA甲基化水平相關(guān)[22]。動(dòng)物和人體研究均表明下丘腦KISS-1/GPR54基因系統(tǒng)是HPGA激活和青春期啟動(dòng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是GnRH神經(jīng)元和HPGA的重要調(diào)控基因。本研究結(jié)果顯示，GPR54 mRNA表達(dá)和基因片段1 CpG位點(diǎn)甲基化水平在大鼠VOD出現(xiàn)與否組別間存在顯著差異，即進(jìn)入青春期大鼠下丘腦GPR54 mRNA表達(dá)和基因片段1 CpG位點(diǎn)甲基化水平較青春期前發(fā)生顯著改變。且其甲基化水平與大鼠VOD之間存在正相關(guān)，推測GPR54基因片段1 CpG甲基化改變與大鼠青春期啟動(dòng)有關(guān)。另外，BPA干預(yù)組GPR54片段2 CpG甲基化水平顯著低于溶劑對照組，且其 mRNA表達(dá)水平顯著高于BPA空白對照組，提示GPR54片段2 CpG位點(diǎn)甲基化水平降低和mRNA表達(dá)增加，可能是BPA暴露誘導(dǎo)雌性大鼠性早熟的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，BPA干預(yù)組KISS-1 mRNA表達(dá)水平顯著高于空白對照組，但KISS-1基因CpG位點(diǎn)甲基化水平在4組(BPA干預(yù)組、BPA空白對照、E2組和溶劑對照組)間差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這可能與KISS-1基因上游調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)。LOMNICZI等[23]對雌鼠青春發(fā)育啟動(dòng)機(jī)制研究結(jié)果證實(shí)，大鼠下丘腦PcG蛋白是KISS-1基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子和主要抑制蛋白。大鼠在青春期啟動(dòng)關(guān)鍵期，下丘腦PcG蛋白關(guān)鍵基因甲基化增強(qiáng)導(dǎo)致PcG蛋白表達(dá)下降，對KISS-1基因的轉(zhuǎn)錄抑制減少，引起KISS-1基因表達(dá)增強(qiáng)從而激活青春期的啟動(dòng)。如果PcG蛋白關(guān)鍵基因啟動(dòng)子的甲基化被抑制，大鼠則無法進(jìn)入青春期發(fā)育。因此，推測BPA可能通過DNA甲基化機(jī)制作用于大鼠下丘腦PcG蛋白關(guān)鍵基因啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)，導(dǎo)致PcG蛋白關(guān)鍵基因抑制或沉默，繼而PcG蛋白阻斷轉(zhuǎn)錄活化因子與KISS-1基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的功能下調(diào)，PcG蛋白抑制KISS-1基因轉(zhuǎn)錄作用減弱，從而使得KISS-1基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。也即，BPA暴露誘導(dǎo)雌性大鼠性早熟的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，并不是直接通過改變KISS-1基因CpG位點(diǎn)甲基化實(shí)現(xiàn)，提示青春期啟動(dòng)涉及興奮和抑制雙向有序調(diào)節(jié)的多基因功能網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，其明確機(jī)制有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究和驗(yàn)證。

本研究將E2干預(yù)組作為大鼠VOD提前的陽性對照[24]。結(jié)果顯示，E2組VOD提前較BPA干預(yù)組更早，E2干預(yù)組大鼠卵巢ERβ基因mRNA表達(dá)和CpG位點(diǎn)甲基化水平均與溶劑對照組間存在顯著差異，且E2下丘腦KISS-1 mRNA表達(dá)水平明顯低于溶劑對照組。表明E2暴露可通過改變ERβ基因CpG位點(diǎn)甲基化水平，從而下調(diào)卵巢ERβ基因mRNA表達(dá)水平。卵巢ERα作用以引起卵泡細(xì)胞增殖為主，而ERβ則是卵巢組織中雌激素發(fā)揮作用的重要受體和途徑[25]。推測雌性幼鼠給予高濃度E2干預(yù)，一方面可通過ERβ基因CpG位點(diǎn)甲基化機(jī)制下調(diào)ERβ表達(dá)水平，另一方面可能導(dǎo)致下丘腦 KISS-1 基因神經(jīng)元應(yīng)對性激素正反饋通路破壞導(dǎo)致KISS-1 mRNA表達(dá)水平下降，最終干擾和破壞HPGA的正常功能。

綜上所述，本研究初步探討了BPA暴露誘導(dǎo)雌性大鼠性早熟的下丘腦KISS-1和GPR54基因甲基化分子機(jī)制，提示下丘腦GPR54基因甲基化水平改變可能是BPA生殖毒性機(jī)制之一。筆者期待DNA甲基化和組蛋白修飾結(jié)合特定細(xì)胞群分離術(shù)等先進(jìn)技術(shù)，以表觀遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制為突破口，揭示BPA等內(nèi)分泌干擾素與內(nèi)分泌疾病和性發(fā)育異常的關(guān)系，以指導(dǎo)人類更好地應(yīng)對內(nèi)分泌干擾素暴露和相關(guān)疾病的防治。