翟 翰，晏 穎，李 芮，李 勇，許 杰

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科 401147)

骨軟骨瘤(osteochondroma,OC)是一種常見的良性骨腫瘤，約占所有原發(fā)性骨腫瘤的8%～15%[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，單純的OC很少發(fā)生惡變，惡變率約占總的病例的2%，但多發(fā)遺傳性O(shè)C的惡變率可達(dá)5%[2]。髁突增生(condylar hyperplasia,CH)是一種罕見的臨床疾病，其特征是單側(cè)下頜髁突非腫瘤性的過度生長(zhǎng)同時(shí)具有自限性[3]。CH和髁突OC均侵襲下頜骨髁突并表現(xiàn)出某些相同的臨床癥狀，例如面部不對(duì)稱，咬合異常，關(guān)節(jié)痛和顳下頜關(guān)節(jié)功能障礙等。CH有4種組織學(xué)類型。Ⅰ型和Ⅱ型的特征分別是具有連續(xù)和廣泛的增生層和斑塊狀增生層，Ⅰ型的髁突松質(zhì)骨中的軟骨島的數(shù)量多于Ⅱ型。Ⅲ型的特征是軟骨具有大而無規(guī)則的肥大層，同時(shí)其髁突表面不光滑。Ⅳ型的軟骨下骨上緊貼著纖維軟骨層，并且不存在增殖層。Ⅰ型CH最常見，增殖力最強(qiáng)[4]，與髁突OC更加難以區(qū)分。

兩種疾病中出現(xiàn)下頜骨髁突過度生長(zhǎng)而最終導(dǎo)致畸形的原因可能與其中的軟骨細(xì)胞異常增殖有關(guān)。文獻(xiàn)表明，多種生長(zhǎng)因子的差異表達(dá)可以引發(fā)髁突畸形[5]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)了髁突OC和Ⅰ型CH之間軟骨細(xì)胞相關(guān)生長(zhǎng)因子及基因存在顯著差異表達(dá)，為這兩種疾病診斷鑒別提供了新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

通過CT檢查結(jié)合術(shù)中及術(shù)后病理學(xué)檢查診斷出髁突OC患者9例(男5例，女4例年齡23～78歲)，以及在切除髁突的CH患者中，通過蘇木素-伊紅(HE)染色診斷為Ⅰ型CH的患者14例(男8例，女6例年齡21～53歲)。所有研究方案經(jīng)本院人類研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并且均遵照赫爾辛基宣言進(jìn)行。

1.2 組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)染色

將組織切片于4%多聚甲醛中固定48 h，然后經(jīng)過10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣半年，包埋在石蠟中。 用Leica RM2265切片機(jī)(Leica公司，德國(guó))切下矢狀切面(5 μm厚)。然后，根據(jù)制造商的流程，用番紅固綠染色方法對(duì)切片進(jìn)行染色，進(jìn)行病理觀察。免疫組織化學(xué)染色使用專用的抗體COL1α2、FGF-2(Proteintech公司，美國(guó)，1∶100、1∶200)，COL2α1、IGF-1(Abcam公司，美國(guó)，1∶100、1∶200)，TGF-β1、IGF-1R(Santa Cruz公司，美國(guó)，均1∶200)，OCT-4、Sox2(CST公司，美國(guó)，均1∶200)。將切片與胃蛋白酶(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)在常溫培養(yǎng)箱中放置30 min，然后用3% H2O2孵育20 min。使用山羊血清阻斷非特異性結(jié)合。將切片與抗體在4 ℃孵育過夜。 然后根據(jù)制造商規(guī)定的流程，用鏈菌素抗生素蛋白過氧化物酶試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)對(duì)切片進(jìn)行染色，最后用蘇木精復(fù)染。

1.3 免疫熒光染色

將切片與胃蛋白酶(Maixin，DIG-3008，中國(guó))在37 ℃孵育30 min，然后用2.5%牛血清清蛋白(BSA)封閉30 min。然后將組織標(biāo)本與特異性抗PCNA(Abcam，美國(guó)，1∶200)和抗Nestin(Millipore，美國(guó)，1∶200)抗體混合，在4 ℃環(huán)境中孵育過夜。 隨后，將切片與綠色熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(Earthox，美國(guó))在37 ℃孵育1 h。最后使用熒光顯微鏡(Leica，德國(guó))觀察切片并拍照儲(chǔ)存。

1.4 抗酒石酸酶(TRAP)染色

按照TRAP染色的規(guī)范流程操作。將脫蠟的切片在含有萘酚AS-BI(Sigma公司，美國(guó))、N-N二甲基甲酰胺、乙酸鈉緩沖液(pH 5.0)、六偶氮副品紅和酒石酸鈉二水合物的溶液中孵育。最后通過光學(xué)顯微鏡觀察切片并拍照。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

組織用無菌PBS清洗3次，接著切碎標(biāo)本并在0.25%胰蛋白酶(HyClone公司，美國(guó))中消化20 min,接著用3 μg/mL的 Ⅰ型膠原酶消化2 h。洗滌軟骨細(xì)胞后將其懸浮在添加了10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/鏈霉素的高葡萄糖DMEM(HyClone公司，美國(guó))中。然后將細(xì)胞在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在第2代細(xì)胞生長(zhǎng)到60%～70%匯合后，添加生長(zhǎng)因子。

1.6 總RNA提取和實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)

使用TRIzol(TaKaRa,日本)提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用20 μL的反應(yīng)體系，控制反應(yīng)條件依次在：37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s;4 ℃長(zhǎng)期保存。得到的cDNA作為real-time PCR的模板。使用ABI Prism 7500 real-time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國(guó))行PCR反應(yīng),反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。各基因引物序列見表1,以GAPDH作內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 相關(guān)RNA引物序列

續(xù)表1 相關(guān)RNA引物序列

1.7 細(xì)胞增殖測(cè)定

將軟骨細(xì)胞接種在96孔板中，密度為2×103孔，然后用添加了5% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。在第1、3、5和7天使用CCK-8試劑盒分析評(píng)估細(xì)胞增殖能力。最后使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度(A)值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CT成像、番紅固綠染色和TRAP染色觀察

Ⅰ型CH和髁突OC的CT成像均表現(xiàn)為面部不對(duì)稱、頜骨及咬合關(guān)系的代償性變化。此外，髁突的冠狀CT顯示部分髁突OC是帶蒂的病變，主要生長(zhǎng)在髁突頭的前內(nèi)側(cè)表面，而Ⅰ型CH的CT顯示髁突表面光滑(圖1A)。在通過傳統(tǒng)的手術(shù)方式切除髁突OC患者髁突的標(biāo)本中可見病變部分被較厚的軟骨覆蓋(圖1B)，番紅固綠染色髁突OC顯示：髁突上有增厚軟骨層，其深部的松質(zhì)骨中有許多軟骨島。然而，Ⅰ型CH標(biāo)本的軟骨下骨層染色有較厚的肥大層和較少的軟骨島(圖1B)。此外，Ⅰ型CH的軟骨腔內(nèi)表面存在有多個(gè)核的大型TRAP陽(yáng)性細(xì)胞，而在髁突OC軟骨下骨層中幾乎未觀察到明顯的TRAP陽(yáng)性細(xì)胞，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Ⅰ型CH組的TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯多于髁突OC組(P<0.05)，見圖1C。

A:Ⅰ型CH和髁突OC的3D-CT成像及雙側(cè)髁突的相應(yīng)冠狀CT成像；B:右側(cè)髁突可見病變處覆蓋有厚厚的軟骨(箭頭所示)及番紅固綠染色；C:TRAP染色及定量分析。

2.2 軟骨和成骨蛋白與基因的差異表達(dá)

Ⅰ型CH的軟骨層和軟骨下骨層Ⅰ型膠原蛋白(COL1α2)抗體免疫組織化學(xué)染色均呈陽(yáng)性(圖2A、B)，而髁突OC的軟骨僅呈微弱染色。Ⅱ型膠原蛋白(COL2α1)在Ⅰ型CH和髁突OC的軟骨層中呈陽(yáng)性染色，并且在髁突OC中的表達(dá)更強(qiáng)(圖2C、D)。real-time PCR檢測(cè)軟骨相關(guān)基因結(jié)果顯示，髁突OC軟骨細(xì)胞中COL1α2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平相較Ⅰ型CH軟骨細(xì)胞降低了約4倍(P<0.05)，然而與Ⅰ型CH軟骨細(xì)胞相比，髁突OC軟骨細(xì)胞中COL2α1和Sox9 mRNA相對(duì)表達(dá)水平增加了3～4倍(P<0.05)。對(duì)成骨基因的檢測(cè)結(jié)果顯示，髁突OC軟骨細(xì)胞中Runx2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平較軟骨細(xì)胞明顯降低(P<0.05)，而COL10α1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平在兩者間未見明顯變化(圖2E)。

A、B：Ⅰ型CH和髁突OC標(biāo)本中COL1α2的免疫組織化學(xué)染色；C、D：Ⅱ型CH和髁突OC標(biāo)本中COL2α1的免疫組織化學(xué)染色；E:軟骨和成骨基因在Ⅰ型CH和髁突OC中的差異表達(dá)。

2.3 髁突OC軟骨細(xì)胞比Ⅰ型CH軟骨細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)

免疫熒光結(jié)果表明，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和巢蛋白(Nestin)在髁突OC軟骨中的表達(dá)高于在Ⅰ型CH軟骨中的表達(dá)。此外，骨髓腔中的Nestin陽(yáng)性細(xì)胞主要緊貼在髁突OC患者軟骨下骨的邊緣；免疫組織化學(xué)結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子OCT4蛋白在髁突OC軟骨中陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)水平約為Ⅰ型CH的4.5倍，且Sox2蛋白在髁突OC軟骨中表達(dá)也較Ⅰ型CH明顯，見圖3A。real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示檢測(cè)，在髁突OC中與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期相關(guān)的特定基因PCNA、G2細(xì)胞周期蛋白(CCNB1)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、M期誘導(dǎo)磷酸酶(MIP)、轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子OCT4、Nestin表達(dá)水平較Ⅰ型CH顯著增高(P<0.05)，見圖3B。髁突OC原代軟骨細(xì)胞在第5、7天增殖能力較Ⅰ型CH明顯增強(qiáng)，見圖4。

A、B：髁突OC和Ⅰ型CH中PCNA、Nestin的免疫熒光(×100)及OCT4、Sox2蛋白的免疫組織化學(xué)染色(×100)；C、D:real-time PCR檢測(cè)Cyclin D1、CCNB1、MIP、PCNA、Nestin、OCT4和Sox2基因表達(dá)。

圖4 Ⅰ型CH和髁突OC原代軟骨細(xì)胞的增殖曲線

2.4 生長(zhǎng)因子在髁突OC和Ⅰ型CH軟骨中的差異表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-2)，類胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)和IGF-1受體(IGF-1R)在髁突OC軟骨中表達(dá)水平較Ⅰ型CH明顯較多。real-time PCR結(jié)果表明，髁突OC軟骨細(xì)胞中TGF-β1、FGF-2、IGF-1 mRNA的較Ⅰ型CH表達(dá)明顯增加(P<0.05)，IGF-1R mRNA的表達(dá)兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

A、B：免疫組織化學(xué)觀察髁突OC和Ⅰ型CH中生長(zhǎng)因子的表達(dá)差異；C：real-time PCR檢測(cè)Ⅰ型CH和髁突OC軟骨細(xì)胞中生長(zhǎng)因子基因的表達(dá)差異。

3 討 論

根據(jù)臨床病例經(jīng)驗(yàn)來看，下頜骨Ⅰ型CH及髁突OC臨床表現(xiàn)極為相似，僅僅通過目前的臨床診斷方式進(jìn)行鑒別容易誤診。研究表明現(xiàn)有的臨床診斷依據(jù)主要集中在：與髁突OC比較，Ⅰ型CH缺乏特征性的軟骨帽，且關(guān)節(jié)間隙和患側(cè)關(guān)節(jié)的表面無明顯改變[6]。而對(duì)于30歲以上出現(xiàn)面部不對(duì)稱的患者，可能考慮與髁突OC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[7]。而對(duì)于CT觀察無明顯帶蒂的年輕髁突OC患者，實(shí)際上不可能將髁突OC與Ⅰ型CH區(qū)分開來。不僅如此，目前國(guó)際上針對(duì)這兩種患者的手術(shù)方式也存在差異。對(duì)于Ⅰ型CH患者來說，通常采取的是“比例性切除肥大的髁突”的手術(shù)方式，而對(duì)于成年患者，通常還需要用到髁突手術(shù)與正頜外科手術(shù)相結(jié)合的方式。對(duì)于髁突OC患者來說，傳統(tǒng)方法是采用低位或完整切除髁突同時(shí)配合人工關(guān)節(jié)置換術(shù)。根據(jù)患者病灶大小部分切除髁突軟骨病灶以調(diào)整面部的歪斜仍無明確的循證醫(yī)學(xué)依據(jù)[8-9]。SLOOTWEG等[10]將CH根據(jù)組織病理學(xué)特征分為4種類型，Ⅰ型的特征是具有所有類型中最大的增生層和深部的透明軟骨細(xì)胞增厚層，并且在松質(zhì)骨中具有大量的軟骨島。Ⅰ型CH是臨床中最常見的類型，病理檢查顯示其增殖能力很強(qiáng)，因此很難將Ⅰ型CH與髁突OC區(qū)分開。本研究選擇Ⅰ型CH和髁突OC進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和real-time PCR，比較分析軟骨相關(guān)生長(zhǎng)因子、軟骨和成骨基因或蛋白表達(dá)差異及軟骨和成骨細(xì)胞增殖活性的差異，并探討這些因子在鑒別診斷中的價(jià)值，試圖更好地區(qū)分髁突OC和Ⅰ型CH，并為進(jìn)一步研究其機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明與Ⅰ型CH相比，髁突OC顯著表達(dá)Nestin、OCT4和PCNA蛋白,同時(shí)髁突OC軟骨中包含透明軟骨及具有強(qiáng)大增殖能力的早期分化的軟骨細(xì)胞。這充分證實(shí)了髁突OC的軟骨細(xì)胞過表達(dá)軟骨相關(guān)生長(zhǎng)因子并具有更強(qiáng)的增殖能力。研究表明，第1個(gè)可檢測(cè)到的異位細(xì)胞表達(dá)了早期的軟骨細(xì)胞標(biāo)志物，表明OC的形成發(fā)生是在早期分化的軟骨細(xì)胞中，而不是成骨細(xì)胞[11]。研究表明，TGF-β1在軟骨形成的所有階段都很重要，并且在軟骨細(xì)胞分化的后期發(fā)揮抑制劑作用。而IGF-1也可促進(jìn)軟骨生成標(biāo)志物(例如COL2α1和Sox9)的表達(dá)，其作用可通過與TGF-β1結(jié)合而增強(qiáng)，同時(shí)FGF-2可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。此外，一些與軟骨發(fā)育相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，Sox9與軟骨細(xì)胞的分化與增殖密切相關(guān)，但在肥大的軟骨細(xì)胞中不表達(dá)[12]。Runx2在促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化中起重要作用，并且其表達(dá)水平可以反映軟骨的分化程度。在本研究中，髁突OC軟骨細(xì)胞過度表達(dá)COL2α1、Sox9和Nestin，且Runx2的表達(dá)降低，這表明早期分化的軟骨細(xì)胞可能是髁突OC的起源。但是，成骨細(xì)胞主要附著在骨髓腔的邊緣，而骨髓腔中沒有破骨細(xì)胞，這提示軟骨內(nèi)正在發(fā)生成骨發(fā)育異常。相反，Ⅰ型CH軟骨細(xì)胞過表達(dá)COL1α2和Runx2基因。這一發(fā)現(xiàn)與以前的研究結(jié)果一致，表明相較于髁突OC，Ⅰ型CH常常與軟骨內(nèi)骨化相關(guān)。

與此同時(shí)，本研究檢測(cè)了兩個(gè)試驗(yàn)組軟骨相關(guān)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，以確定Ⅰ型CH和髁突OC之間的差異，并探討了髁突OC的形成機(jī)制，其原因可能由于這些生長(zhǎng)因子促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞不斷聚集。另外，在real-time PCR結(jié)果中，筆者觀察到髁突OC中TGF-β1、IGF-1和FGF-2表達(dá)被上調(diào)，而Runx2表達(dá)被下調(diào)。FGF-2已被證明對(duì)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和引起軟骨細(xì)胞肥大具有重要作用[13]。TGF-β1在軟骨形成的所有階段都很重要，在軟骨細(xì)胞分化晚期其通過抑制Runx2等的表達(dá)來抑制分化[14]。 IGF-1則可促進(jìn)軟骨生成標(biāo)志物(例如COL2α1和Sox9)的表達(dá)，并且其作用可通過與TGF-β1協(xié)同作用來增強(qiáng)[15-16]。因此，筆者假設(shè)當(dāng)髁突的異常灶中過表達(dá)生長(zhǎng)因子時(shí)，Sox9的功能增強(qiáng)而Runx2的功能受到抑制，從而導(dǎo)致髁突OC中的間充質(zhì)凝結(jié)和軟骨細(xì)胞增殖。

總之，在分子生物學(xué)特征上，髁突OC和Ⅰ型CH之間存在顯著區(qū)別。但髁突OC中的細(xì)胞增殖相關(guān)基因和生長(zhǎng)因子的表達(dá)明顯高于Ⅰ型CH。而且髁突OC主要由快速增殖的透明軟骨組成，其中的軟骨內(nèi)骨化也少于Ⅰ型CH，這些指標(biāo)為兩種疾病的鑒別診斷提供參考。此外，在病因?qū)W方面，筆者推測(cè)局部軟骨病變和異位軟骨導(dǎo)致了髁突OC的形成，而CH的形成可能是異常的軟骨內(nèi)骨化及軟骨細(xì)胞增殖造成，然而其中具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。