梁穎思 黃家欣 陳秀芬 蘇妙貞 周露

(廣東省食品檢驗所 廣東廣州 510435)

1 前言

生物素(Biotion)又稱為維生素B7，它是一種維持人體自然生長和正常人體機能所必須的水溶性維生素，但是人體無法通過自身代謝合成[1]。因其在食物中分布廣泛，所以一般情況下人體并不缺乏這種維生素，但是嬰兒腸道功能不完善，易導致缺乏生物素而患皮炎，且嬰幼兒在脫離母乳之后，飲食以配方奶粉及各類輔食為主，因此需在嬰幼兒食品中添加適量的生物素以增加嬰幼兒對生物素的攝取[1-2]。

實驗室人員比對實驗是指在相同的儀器設備、實驗項目、環(huán)境和設施條件下，對性能穩(wěn)定的操作對象，由不同的實驗人員進行試驗。只研究1個實驗因素即人員，因素中有2個水平，即檢驗員A與檢驗員B，通過對不同人員的實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，研究人員之間的檢驗數(shù)據(jù)有無顯著性差異[3]。人員比對是實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制中主要的有效措施之一，有助于了解實驗室的檢測能力，為實驗室檢驗結果的準確性、重現(xiàn)性、可驗證性打下良好基礎；同時，通過內(nèi)部人員比對有助于了解自身不足，量化實驗室系統(tǒng)誤差，以便采取相應的完善措施[4]。

隨著國家對食品安全問題愈發(fā)重視，對食品檢驗機構的能力要求也越來越高，作為食品微生物實驗室，應當不斷提高檢驗員的檢測能力，增強實驗室的質(zhì)量控制[5]。本文按照GB 5009.259-2016《食品安全國家標準 食品中生物素的測定》與內(nèi)部質(zhì)量控制技術要求的規(guī)定進行實驗，通過對檢驗員的質(zhì)量控制，為本實驗室的質(zhì)量控制提供可靠的數(shù)據(jù)，確保檢驗數(shù)據(jù)的準確性。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

水浴鍋(德國ika/艾卡ICC basic eco 18)；Ph計(梅特勒-托利多)；離心機(Beckman Allegra 64R)；生物安全柜(新加坡ESCO)；生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)；酶標儀(日本島津)；生物素檢測試劑盒(德國拜發(fā)公司)。

2.2 樣品及質(zhì)控樣品

嬰配樣品：廣東省食品檢驗所提供的某品牌嬰兒配方奶粉2段(營養(yǎng)成分表中生物素含量為12.0 μg/100 g)。

質(zhì)控樣品：購于中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心的嬰幼兒配方乳粉(編號為QC-IP-017，證書結果證明樣品中生物素的含量指定值為26.00 μg/100 g，滿意值范圍為21.56～30.44μg/100 g)。

2.3 樣品處理

分別稱取1 g樣品溶入30 ml蒸餾水；用HCl或NaOH調(diào)整pH至8.0±0.2，搖勻，用蒸餾水定容40 ml；95℃水浴30 min，每5 min震蕩1次，確保離心管塞緊閉；迅速冷卻至30℃以下；樣品過0.2μm獨立包裝無菌濾膜；樣品系列稀釋。

2.4 培養(yǎng)基制備

用鑷子取出培養(yǎng)基中的干燥劑袋，加入10 ml無菌水，95℃水浴5 min，每2 min震蕩1次，保持瓶子密封，水浴后迅速冷卻至室溫；用無菌濾膜過濾至一次性無菌離心管中。

2.5 標準品的制備

標準品濃縮液：取試劑盒所帶無菌水2 ml至標準品瓶，混勻。

表1 生物素標準曲線制備表

2.6上板

取相應數(shù)量的微孔板條至板架，分別加入150 μl的培養(yǎng)基和150μl的標準品或樣品：

QC1 QC1 QC1 C1 Std1 Std1 Std1 C2 Std2 Std2 Std2 C3 Std3 Std3 Std3 Std4 Std4 Std4 Std5 Std5 Std5 P1 P1 P1 P2 P2 P2

用試劑盒中的密封膠片將所有微孔密封，然后在36℃黑暗條件下孵育48 h。

2.7 讀數(shù)

孵育完畢后，將微孔板倒置于桌面，進行震蕩使其混勻；之后揭去粘合箔并去除微孔液體表面的氣泡，并盡快用酶標儀在630 nm波長下進行讀數(shù)。

2.8 結果計算

使用R-Biopharm公司提供的RidaWin軟件對結果進行分析。

樣品中生物素含量(μg/100g)=(標準曲線上讀取的樣品濃度×稀釋倍數(shù))/樣品總量

3 結果與分析

3.1 標準曲線繪制

在“RidaWin”軟件中，以生物素標準品的質(zhì)量分數(shù)作為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制出準曲線。標準曲線質(zhì)量分數(shù)在0～0.72μg/100 g范圍內(nèi)時，2名檢驗員檢測生物素標準曲線的線性關系良好，分別為：R2=0.9994(圖1a)和R2=0.9978(圖1b)。檢驗的R2值均大于0.99，符合標準GB/T 27404-2008[6]中線性回歸方程相關系數(shù)的要求。

3.2 樣品及質(zhì)控樣品中生物素的測定

對2名檢驗員檢測結果(表2)進行顯著性差異分析，發(fā)現(xiàn)兩者測定的生物素的數(shù)值差異不顯著(P>0.05)。

表2 二者對生物素測定的結果

乳粉質(zhì)控樣品生物素的測定值范圍是21.56～30.44μg/100g，指定值為26.00μg/100g。二者的測定值均在質(zhì)控樣品測定值的范圍內(nèi)，與指定值相比，檢驗員A的測定值較低，為5.77%，檢驗員B的測定值較高，為13.46%，均屬于可接受水平(±17.08%)。

測定結果根據(jù)內(nèi)部質(zhì)量控制的技術要求，進行復現(xiàn)性計算，對各自的測定結果取對數(shù)值，以兩者實驗結果之間的絕對差值不大于復現(xiàn)性限為結果滿意[7]，此次的人員比對復現(xiàn)性R=0.03(R<0.45)，故此次人員比對結果為滿意。

4 結論

基于王晶、梁美丹、張旺、周敏等人的研究探索[8-11]，試劑盒法操作簡單，利于實驗室應用與樣品檢驗，且國標法中亦有提到試樣提取液也可采用預先包埋了菌種的微生物法生物素試劑盒測定，效果相當[12]，故本次人員比對采用了試劑盒法進行試驗。

生物素檢測方法有多種，包括微生物法、色譜法、熒光法等，當前，生物素微生物檢測法被美國AOAC和中國國家標準選定為仲裁方法，方法原理是利用植物乳桿菌對有活性生物素的特異性，從而檢測出生物素[9]。在本文中基于微生物檢測的原理，使用試劑盒法對2名檢驗員進行嬰幼兒配方奶粉中生物素檢測的人員比對，從比對結果可知兩者測定的生物素的結果差異不顯著，兩者的測定結果均表明該奶粉中生物素的含量符合營養(yǎng)成分表(生物素含量>12.0μg/100g)。

本文在實驗前進行了多次預實驗，在預實驗中發(fā)現(xiàn)一些問題：標準曲線線性關系不好(R2<0.99)；因估算不準，樣品稀釋倍數(shù)選取不正確，導致測出結果不在標準曲線范圍內(nèi)；個別微孔讀取的樣品濃度平行性差異較大。

通過對檢測步驟加以分析總結，得出以下實驗要點：該實驗易受外界因素干擾，在操作中注意無菌的同時，實驗中所使用到的器皿還須避免各種雜質(zhì)的干擾，特別是玻璃器皿，在使用前應用2%的鹽酸液浸泡數(shù)小時，洗凈烘干后再使用；在樣品處理時，注意稀釋倍數(shù)的選取，若估算不準，應嘗試多個稀釋度，并注意稀釋液的均勻性；在上板時因加樣量大，要謹慎細致，加液體時沿孔壁加入，以防液體飛濺污染其它孔影響試驗結果；讀數(shù)前須將板內(nèi)培養(yǎng)物充分混勻并保證讀數(shù)時每孔的空氣都排盡，保證結果的準確性。

綜上所述，通過人員比對，可以分析總結在實驗中易出現(xiàn)的問題，提高檢驗員的檢測能力，從而提升實驗室的檢測水平。應定期開展內(nèi)部人員比對進行質(zhì)量控制，確保檢驗數(shù)據(jù)的準確性。并注意保存每次實驗的樣品信息和數(shù)據(jù)結果，為之后的測定提供參考，提高檢測效率。