蔡友錚，孫麗清，盧燕，黃玉鈿，鄭友珍，翁雅彬

福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，福建福州 350005

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）的發(fā)病率位居頭頸惡性腫瘤之首，早期臨床癥狀不典型，同時具有高轉(zhuǎn)移、高復(fù)發(fā)和低分化的特征，因此臨床上極難較早發(fā)現(xiàn)[1-4]。HMGB1（high mobility group box-1 protein）異常表達(dá)與口腔癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌、大腸癌、胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5-7]。但目前對于HMGB1與鼻咽癌的關(guān)系還缺乏了解[8-11]。該研究方便選取2019年10月—2020年9月福州市第一醫(yī)院耳鼻咽喉科診斷治療的鼻咽炎和鼻咽癌患者臨床標(biāo)本各25例，探索HMGB1高表達(dá)與鼻咽癌發(fā)生的相關(guān)性，并初步驗(yàn)證HMGB1對體外培養(yǎng)的鼻咽癌細(xì)胞生長、侵襲和遷移的影響，為能否通過檢測HMGB1對鼻咽癌進(jìn)行診斷、治療以及預(yù)后評估提供新的策略?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取在福州市第一醫(yī)院耳鼻咽喉科診斷治療的鼻咽炎和鼻咽癌患者共50例，根據(jù)病理報(bào)告分為兩組，鼻咽炎25例，其中男15例，女10例；年齡最小25歲，最大60歲，平均年齡（45±8）歲。鼻咽癌25例，其中男13例，女12例；年齡最小22歲，最大63歲，平均年齡（42±9）歲。所選患者均符合臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，已簽署知情同意書，且經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。兩組患者的一般資料經(jīng)對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 試劑 人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2購自逸漠生物公司。HMGB1shRNA（#1～3）及空載體對照的慢病毒購自載基生物有限公司，HMGB1抗體購自proteintech公司。CCK8增強(qiáng)型溶液、草胺酸結(jié)晶紫染色液（0.1%）購自meilune公司。Matrigel膠，Transwell小室及24孔遷移板購自美國corning公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 鼻咽癌及鼻咽炎患者樣本石蠟包埋后切片（4～5μm）,使用兔/鼠IgG-兩步法免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒（博士德生物公司）染色，具體步驟參照試劑盒說明書。正置顯微鏡下觀察拍照，統(tǒng)計(jì)染色呈陽性細(xì)胞百分比。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) CNE2細(xì)胞用DMEM(高糖)基礎(chǔ)培養(yǎng)基加10%胎牛血清及抗生素培養(yǎng)，間隔1～2 d更換培養(yǎng)液，細(xì)胞生長至80%左右消化傳代。

1.2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染 狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)7～12 h。對照（含有空載體）和含有HMGB1shRNA病毒在冰上緩慢融化后，根據(jù)病毒滴度等量稀釋到1 mL加入6孔板，6 h后重復(fù)轉(zhuǎn)染1次，12 h后換成普通培養(yǎng)基并加入嘌呤霉素篩選，得到穩(wěn)轉(zhuǎn)株。穩(wěn)轉(zhuǎn)株RT-qPCR驗(yàn)證干擾效率。

1.2.5 細(xì)胞增殖檢測 96孔板按每孔8×104個接種細(xì)胞，24 h后每孔加入10μl的CCK-8溶液，培養(yǎng)1.5 h后測其OD450。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng),待細(xì)胞長至80%～90%左右，用移液器槍頭直線劃痕，PBS輕柔清洗兩遍以去除漂浮細(xì)胞，在不同時間點(diǎn)觀察，并分別測量各孔的劃痕寬度。

1.2.7 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞胰酶消化后，在無血清培養(yǎng)基中將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×105/mL，Transwell小室每個加入200μl的細(xì)胞懸液，小室下的孔中加入含10%血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 d，倒出培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定已遷移到濾膜外側(cè)的細(xì)胞并用結(jié)晶紫染色，再擦去濾膜內(nèi)側(cè)的細(xì)胞，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，每孔計(jì)數(shù)5個視野，取平均值。

1.2.8 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 按1:9的比例稀釋Matrigel膠，鋪于Transwell底部濾膜上，用來模擬細(xì)胞外基質(zhì)，重復(fù)1.2.6實(shí)驗(yàn)步驟。

1.2.9 RT-qPCR使用RNAiso Plus試劑盒（TaKaRa）提取細(xì)胞總RNA，并用NovoScriptPlus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒（Novoprotein）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體步驟參照試劑盒說明書。分別用HMGB1和GAPDH引物對反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算細(xì)胞中HMGB1 mRNA水平。

1.3 觀察指標(biāo)

比較鼻咽炎與鼻咽癌患者組織的HMGB1陽性細(xì)胞百分比。比較HMGB1shRNA病毒轉(zhuǎn)染的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中HMGB1的mRNA表達(dá)水平，CCK-8活性，及其在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中的劃痕寬度變化，以及在Transwell實(shí)驗(yàn)中同等面積下發(fā)生遷移或侵襲的細(xì)胞個數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（(±s）表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1在鼻咽癌中高表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色檢測鼻咽癌及鼻咽炎患者樣本各25例。結(jié)果顯示，鼻咽癌患者組織的HMGB1陽性細(xì)胞百分比為（17.79±12.71）%，顯著高于鼻咽炎患者組織的HMGB1陽性細(xì)胞百分比（7.80±5.57）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.597,P＜0.05）,表明HMGB1在鼻咽癌中高表達(dá)。見圖1。

圖1 HMGB1在鼻咽癌組織中高表達(dá)

2.2 敲低HMGB1后抑制鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的增殖

對 照 和 含 有HMGB1shRNA#1、HMGB1shRNA#2、HMGB1shRNA#3的病毒轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞后經(jīng)嘌呤霉素篩選，得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。RT-qPCR結(jié)果顯示，與對照組相比，HMGB1shRNA#1、HMGB1shRNA#2、HMGB1shRNA#3病毒轉(zhuǎn)染的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中HMGB1的表達(dá)水平均有下調(diào)（P＜0.05），其中HMGB1shRNA#1病毒轉(zhuǎn)染的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中HMGB1的表達(dá)水平下降最明顯，見圖2A。故此后的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均選擇使用HMGB1sh RNA#1病毒轉(zhuǎn)染的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（以下簡稱HMGB1sh RNA#1細(xì)胞）。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞相比，HMGB1shRNA#1細(xì)胞的增殖能力顯著減弱（P＜0.05），見圖2B。表明HMGB1能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的增殖。

圖2 敲低HMGB1后抑制鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的增殖

2.3 敲低HMGB1后抑制鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的遷移

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照細(xì)胞和HMGB1shRNA#1細(xì)胞在0 h時的劃痕寬度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而24 h時HMGB1shRNA#1細(xì)胞的劃痕寬度顯著大于對 照 組， 差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 （P＜0.05）， 說 明HMGB1shRNA#1細(xì)胞遷移能力顯著下降。而Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)也顯示，與對照細(xì)胞相比，發(fā)生遷移的HMGB1shRNA#1細(xì)胞顯著減少（P＜0.05），進(jìn)一步驗(yàn)證了HMGB1shRNA#1細(xì)胞遷移能力下降。這些都表明HMGB1能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的遷移。見圖3、圖4。

圖3 敲低HMGB1后抑制鼻咽癌細(xì)胞株CNE2在劃痕實(shí)驗(yàn)中的遷移能力

圖4 敲低HMGB1后抑制鼻咽癌細(xì)胞株CNE2在Transwell實(shí)驗(yàn)中的遷移能力

2.4 敲低HMGB1后抑制鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的侵襲

Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照細(xì)胞相比，HMGB1shRNA#1細(xì)胞發(fā)生侵襲的顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明HMGB1shRNA#1細(xì)胞侵襲能力下降。表明HMGB1能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的侵襲。見圖5。

圖5 敲低HMGB1后抑制鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的侵襲能力

3 討論

HMGB1隸屬于高遷移率族蛋白，主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，是一種不屬于組蛋白的染色體結(jié)合蛋白，與體內(nèi)如細(xì)胞的增殖、分化和遷移等多種生命活動有關(guān)[5,10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1與其受體的異常表達(dá)與口腔癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌、大腸癌、胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中有著重要作用[5-11]。近期的研究顯示，在大腸癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤里，HMGB1還能被腫瘤細(xì)胞分泌到細(xì)胞外，通過自分泌與旁分泌促進(jìn)自身和其他腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，提高腫瘤細(xì)胞的放療耐受性[12-15]。相較于其他腫瘤，目前對于HMGB1在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中作用機(jī)制的研究還十分有限。

該研究的結(jié)果表明，HMGB1在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中也有著重要作用。鼻咽癌患者組織的HMGB1陽性細(xì)胞百分比 （17.79±12.71）%顯著高于鼻咽炎患者（7.80±5.57）%（t=3.597,P＜0.05）；而此前的報(bào)道顯示，HMGB1在口腔鱗癌組織中的高表達(dá)率（67.46%）高于口腔黏膜正常組織（0.00%）（χ2=13.242，P＜0.001）[16]，在直腸癌組織中高表達(dá)率（52.2%）顯著高于在癌旁組織（21.7%）(χ2=9.144，P=0.002)[17]；表明鼻咽癌和口腔鱗癌及直腸癌都存在HMGB1高表達(dá)。而對體外培養(yǎng)的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的增殖和轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示，敲低HMGB1的表達(dá)水平后，細(xì)胞增殖明顯減慢（P＜0.05），細(xì)胞遷移能力下降（P＜0.05），細(xì)胞侵襲能力下降 （P＜0.01）；而此前的研究顯示，人鼻咽癌細(xì)胞株C666-1中干擾HMGB1的表達(dá)后，細(xì)胞增殖明顯減慢（P＜0.001），遷移能力明顯下降（P＜0.001）,侵襲能力明顯減弱（P＜0.001）[18-19]；雖然由于兩株人鼻咽癌細(xì)胞株本身遺傳背景不同，HMGB1表達(dá)水平不同，實(shí)驗(yàn)中HMGB1敲低或干擾的效率也有很大差別，導(dǎo)致兩組實(shí)驗(yàn)根本不存在任何可比性，但兩者都得到了相同的結(jié)論，說明HMGB1能促進(jìn)細(xì)胞增殖，增強(qiáng)遷移能力和侵襲能力。這些結(jié)果都表明HMGB1可能對鼻咽癌發(fā)生發(fā)展有重要的促進(jìn)作用，但對于HMGB1促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移的具體信號通路還有待今后的進(jìn)一步研究。

鼻咽癌是一種源自于鼻咽部上皮細(xì)胞且具有特殊人種和地域分布的實(shí)質(zhì)性惡性腫瘤，其發(fā)病率位居頭頸惡性腫瘤之首[1-4]。由于鼻咽癌的解剖位置隱匿、早期臨床癥狀不典型，同時具有高轉(zhuǎn)移、高復(fù)發(fā)和低分化的特征，因此臨床上極難較早發(fā)現(xiàn)，早期診斷率不到20%。而鼻咽癌目前臨床上治療主要以放療及輔助化療為主[1-4,20-21]。盡管近年來隨著治療手段的不斷進(jìn)步，患者的生存率得到顯著提高，但鼻咽癌早期即易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能，而一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移則預(yù)后很差[22-23]。因此，尋找新的鼻咽癌特異性標(biāo)志物和預(yù)后評估因子，對治療鼻咽癌有著重要作用。該研究發(fā)現(xiàn)HMGB1不僅在鼻咽癌樣本中高表達(dá)且能直接促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，不僅有助于更好地了解鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，更可以為鼻咽癌的早期診斷和治療提供新的方向和目標(biāo)。