田慶龍，章政，王全，宋長(zhǎng)悅

1.黑龍江天元婦產(chǎn)醫(yī)院影像科，黑龍江哈爾濱 150000；2.黑龍江省醫(yī)院影像科，黑龍江哈爾濱 150000

近年來(lái)隨著公眾健康意識(shí)的提高，體檢患者的數(shù)量逐年攀升，傳統(tǒng)的X線平片在胸部檢查時(shí)對(duì)于小結(jié)節(jié)的漏診率較高，待臨床癥狀出現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)時(shí)多屬于中晚期，患者的遠(yuǎn)期生存率差。低劑量螺旋CT（low dose ccomputed tomography，LDCT）的快速發(fā)展，憑借其輻射劑量低，分辨力高，對(duì)肺部疾病診斷敏感，一躍成為胸部體檢的首選檢查，低劑量CT掃描后薄層重建，對(duì)肺部小結(jié)節(jié)細(xì)微影像學(xué)特征顯示較好，可以對(duì)肺小結(jié)節(jié)早期定性提供一定的診斷依據(jù)[1-2]。肺癌發(fā)生早期通常伴隨一些基因的異常表達(dá)，其中P16基因的異常甲基化與其關(guān)系密切，檢測(cè)P16基因的甲基化有助于肺小結(jié)節(jié)良惡性的早期鑒別[3-7]。該研究方便選取2018年2月—2019年10月間進(jìn)行胸部檢查患者1 115例，探究低劑量CT（LDCT）薄層重建聯(lián)合外周血清P16基因甲基化檢測(cè)，能否進(jìn)一步提高肺小結(jié)節(jié)早起定性的準(zhǔn)確率，從而達(dá)到早診斷早治療的目的。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取進(jìn)行肺部低劑量CT掃描的患者1 115例，納入標(biāo)準(zhǔn)：患者身體健康，有能力自主完成屏氣掃描過(guò)程，既往檢查已知自身患有肺小結(jié)節(jié)（≤1 cm）。排除標(biāo)準(zhǔn)：有其他腫瘤病史或近一年內(nèi)進(jìn)行過(guò)CT掃描，有肺部手術(shù)史，近一月有發(fā)燒、感冒、咳嗽等呼吸道癥狀。將1 115例患者隨機(jī)分為兩組，一組557例（LDCT薄層重建-P16組），行低劑量螺旋CT掃描薄層重建聯(lián)用外周血清P16基因甲基化檢測(cè)；二組558例（LDCT組），僅采用普通低劑量螺旋CT掃描。LDCT薄層重建-P16組平均年齡（57±24）歲，LDCT組平均年齡（59±26）歲，兩組間男女比例均約為1∶3。兩組間數(shù)量、年齡、性別及健康狀態(tài)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。具有可比性。

該研究經(jīng)過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)討論審核通過(guò)，告知患者及家屬相關(guān)內(nèi)容及注意事項(xiàng)，并簽署知情同意書。

1.2 方法

兩組待檢患者均采用德國(guó)西門子SOMATOM Scope 16排螺旋CT掃描，掃描體位：仰臥位，雙臂上舉過(guò)頭頂，頭先進(jìn)，自主屏氣后進(jìn)行全肺掃描。電壓設(shè)定為100 kV，電流50 mAs，層厚5 mm，螺距1.5。

1.3 圖像重建

圖像重建是采用SIEMENS公司研發(fā)出圖像空間迭代重建算法 (iterative reconstruction in image space,IRIS)，IRIS是將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行空間迭代循環(huán)重建，這種算法生成的圖像信噪比高，圖像細(xì)節(jié)顯示較清晰。LDCT薄層重建-P16組原始數(shù)據(jù)使用薄層重建，重建層厚設(shè)定為1 mm，肺窗（-600 HU,1 200 HU），縱隔窗（40 HU，400 HU）。LDCT組原始數(shù)據(jù)僅使用IRIS算法重建，窗技術(shù)條件如上。

1.4 圖像分析

兩組CT圖像由兩位放射科醫(yī)師（主治及以上）獨(dú)立完成閱片，并匯總可疑惡性征象，意見不同時(shí)，科室內(nèi)其他醫(yī)師一起會(huì)診討論，直至結(jié)果達(dá)成一致。觀察內(nèi)容包括肺結(jié)節(jié)的密度、毛刺、分葉、胸膜牽拉、小泡征，鈣化（見表1），結(jié)節(jié)內(nèi)沒有鈣化且滿足前4種影像征象中的其中3種即為陽(yáng)性病例。

表1 兩組病灶影像學(xué)特征比較（n）

1.5 P16基因甲基化檢測(cè)

LDCT薄層重建-P16組患者簽署知情同意書，晨起無(wú)進(jìn)食，近期無(wú)發(fā)熱，無(wú)用藥，采靜脈血10 mL，低溫離心，-70℃放置于恒溫箱。按照QIAamp blood kit操作步驟提取血清DNA，然后進(jìn)行硫酸氫鹽修飾。取含DNA溶液50μl，加入4 mol/L NaOH,使樣品濃度為0.2 mol/L，在37.5℃恒溫水中保持10 min使其變性，再加入30μl的10 mmol/L的氫醌（現(xiàn)用現(xiàn)配）及pH值為5.0、濃度為3 mol/L的NaHSO3520μl，上層均勻涂薄層礦物油，暗室中將其放置在50℃的溫水內(nèi)16 h。應(yīng)用Promega公司生產(chǎn)的DNA純化試劑盒修飾DNA，常溫23℃加入4 mol/L NaOH至濃度為0.3 mol/L，靜置5～20 min，脫硫。最后加入17μl濃度10 mol/L醋酸銨及51μl的冰乙醇，在制冷箱內(nèi)-20℃沉淀DNA后，室溫下干燥，-20℃恒溫保存待用。采用德國(guó)Biometra公司生產(chǎn)核酸擴(kuò)增（PCR）儀,參照相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)兩組引物[3]，分別為P16基因甲基化引物，組成結(jié)構(gòu)為5’-TTATTAGAGGGTGGGGCG2GATCGC和5’-GACCCCGACCGCGACCGTTA，片段長(zhǎng)度為150 bp。P16基因非甲基化引物，組成結(jié)構(gòu)為5’-TATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT和5’-CAACCCCAAACCACAAC-CATAA，長(zhǎng)度片段為151 bp。反應(yīng)液總體積50μl，經(jīng)NaHSO3處理后的取樣DNA約為50μg，各引物300μg。PCR緩沖液（16.6 mmol/L硫酸銨，67 mmol/L Tris-HCL，10 mmol/L 2-巰基乙醇，等。溶液pH值8.8）。首先，在95°C下添加引物10 min，添加2.0 U DNA polymerase（美國(guó)Promega），然后在95°C，60°C，72°C下循環(huán)40次，各溫度30 s，最后在72°C延長(zhǎng)5 min。然后將得到的PCR產(chǎn)物適當(dāng)稀釋（約為30倍），并將10μl用于下一次PCR擴(kuò)增。退火溫度設(shè)定為65℃，持續(xù)時(shí)間減少到15 s，其他順序及條件與上次相同。待擴(kuò)增完畢，取10μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，均勻涂于2.5%瓊脂糖凝膠上的待檢位置，甲基化的陽(yáng)性對(duì)照選用經(jīng)過(guò)甲基化處理的胎盤DNA，陰性對(duì)照選取正常外周血中的淋巴細(xì)胞DNA，空白對(duì)照用H2O。將待檢各組涂抹完畢進(jìn)行電泳分離，最后用溴化乙錠進(jìn)行最終處理染色，進(jìn)行比較分析。

1.6 P16基因甲基化判斷

甲基化引物檢測(cè)的電泳結(jié)果對(duì)比陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照，可疑惡性患者可以觀察到在100～200 bp間擴(kuò)增出特異性帶，與陽(yáng)性對(duì)照組位置相同，與陰性對(duì)照組位置不同，記錄為甲基化陽(yáng)性病例，空白對(duì)照組無(wú)任何特意帶顯示。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分率（%）表示，組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

LDCT薄層重建-P16組557例患者均完成低劑量掃描后薄層重建，551例完成血清P16基因甲基化檢測(cè)，所以LDCT薄層重建和P16基因甲基化檢測(cè)總完成率約98.92%，其中LDCT薄層重建得到陽(yáng)性病例215例（約38.60%），P16基因甲基化檢測(cè)陽(yáng)性病例247例（約44.34%），最后得出兩項(xiàng)同時(shí)陽(yáng)性的病例182例，LDCT薄層重建-P16組陽(yáng)性病例檢出率約為32.68%。以上182例兩項(xiàng)同時(shí)陽(yáng)性患者，其中176例胸腔鏡手術(shù)或穿刺進(jìn)一步病理學(xué)檢查，結(jié)果155例肺惡性腫瘤，腺癌居多共84例（見圖1），鱗癌22例，腺鱗癌24例，小細(xì)胞癌25例。其他陽(yáng)性患者后期3個(gè)月隨訪有13例結(jié)節(jié)明顯增大或肺內(nèi)結(jié)節(jié)增多，后胸腔鏡手術(shù)或穿刺病理證實(shí)為肺惡性腫瘤，其中3例為轉(zhuǎn)移瘤，其他患者目前仍在隨訪中，該組檢查準(zhǔn)確率約為92.31%。

圖1 LDCT薄層重建-P16陽(yáng)性病例圖像

LDCT組全部完成低劑量CT掃描，經(jīng)過(guò)影像科專家嚴(yán)格分析后最后得到可疑惡性52例，陽(yáng)性檢出率約為9.32%。52例陽(yáng)性病例中46例進(jìn)行手術(shù)或穿刺病理學(xué)檢查；其中惡性腫瘤27例：腺癌15例，其他類型12例，準(zhǔn)確率約為51.92%。該研究所有陰性患者均仍在定期隨訪，懷疑惡性的目標(biāo)對(duì)象3個(gè)月隨訪。

LDCT薄層重建-P16組其靈敏度高達(dá)93.33%[（168/（168+12）]， 準(zhǔn) 確 率92.31%均 高 于LDCT組（65.85%，51.92%），兩組特異度96.22%[（357/（357+14）]與95.28%[485/（485+24）]，兩組檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

CT檢查比普通胸片具有更高的分辨率[8]，且空間立體感強(qiáng)，為肺部小結(jié)節(jié)的早期發(fā)現(xiàn)提高了敏感性，但常規(guī)CT掃描輻射劑量較大，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)成人胸部CT輻射劑量診斷參考水平（DRL）為332 mGy·cm[9]，一次成人胸部常規(guī)CT檢查有效輻射劑量約為3～27 mSv，是普通胸片的數(shù)十甚至上百倍[10]，對(duì)于CT檢查所帶來(lái)的輻射傷害患者通常心存忌憚，低劑量CT（LDCT）的快速發(fā)展完美解決了輻射劑量問題，該次檢查的平均有效輻射劑量約為（1.12±0.27）mSv，相關(guān)研究低劑量CT胸部檢查的輻射劑量可以降低至（0.82±0.24）mSv[11]，兩者差異不大，均明顯低于常規(guī)CT最低輻射劑量[10]，且可以滿足臨床診斷需要。每年低劑量CT體檢一次，較采用常規(guī)胸片檢查，肺癌病死率可降低約20%[12-13]。薄層重建技術(shù)更是將以往看不到的肺小結(jié)節(jié)特征清晰的呈現(xiàn)到診斷醫(yī)師眼前，重建后的圖像病變顯示更細(xì)膩，分辨力更好[14-16]，對(duì)于肺小結(jié)節(jié)良惡性早期診斷有很大幫助。

經(jīng)研究表明，腫瘤的形成常伴隨某些基因的異常表達(dá)或者抑癌基因的失活，P16基因位于人類染色體的9q21區(qū)[17]，是人體內(nèi)一種重要抑癌基因，它可以有效地抑制特異細(xì)胞增殖，具有延緩細(xì)胞周期的特殊制動(dòng)作用，它通常作用于細(xì)胞分裂周期內(nèi)的特定階段，其關(guān)鍵區(qū)域CPG島異常結(jié)構(gòu)改變，常見如甲基化現(xiàn)象，會(huì)導(dǎo)致其正常功能喪失，當(dāng)P16基因由于甲基化而失活后，可以引起PRB基因持續(xù)異常狀態(tài)的磷酸化，此時(shí)不受抑制的特異細(xì)胞會(huì)急劇增多，最終導(dǎo)致腫瘤形成[18]，所以P16基因相關(guān)研究已經(jīng)成為肺癌診斷研究熱點(diǎn)之一。大量研究顯示P16基因異常甲基化，很多身體的其他部位腫瘤或疾病也可以呈現(xiàn)陽(yáng)性改變[19-21]，對(duì)肺小結(jié)節(jié)的定性診斷存在一定的假陽(yáng)性,所以單獨(dú)應(yīng)用此項(xiàng)檢測(cè)不足以達(dá)到定位定性的診斷目的。

肺小結(jié)節(jié)定義在直徑＜1 cm，普通低劑量掃描層厚較大，對(duì)肺小結(jié)節(jié)細(xì)微的結(jié)構(gòu)顯示不清晰，通常僅用于肺小結(jié)節(jié)的篩查和定位，達(dá)不到臨床定性診斷的要求。低劑量CT薄層重建1 mm觀察肺小結(jié)節(jié)，可以很好地分析其影像學(xué)特征，對(duì)良惡性的判斷可以提供一定的診斷依據(jù)，但對(duì)于較小的結(jié)節(jié)單純依靠影像學(xué)檢查，并不能提高惡性結(jié)節(jié)的診斷準(zhǔn)確率，反而過(guò)早干預(yù)會(huì)造成一定的醫(yī)患矛盾。

通過(guò)該研究現(xiàn)階段病理反饋結(jié)果可以看出LDCT薄層重建聯(lián)合外周血清P16基因甲基化檢測(cè)對(duì)肺小結(jié)節(jié)良惡性診斷明顯優(yōu)于單純的低劑量CT掃描，且手術(shù)后患者分期98%以上是I期，極大提高了患者的生存率，同時(shí)降低臨床上對(duì)肺小結(jié)節(jié)的過(guò)度診療，作為一種無(wú)創(chuàng)、低輻射的檢查手段，對(duì)肺小結(jié)節(jié)早期良惡性診斷有著極大的幫助。