沈沐瑤，李佳洋，孫菁，王婧螢，王馨詣，郭海英*，徐道明，朱媛媛

（1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210033；2.鹽城市第一人民醫(yī)院，江蘇 鹽城 224041；3.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029；4.南通市第六人民醫(yī)院，江蘇 南通 226001）

絕經(jīng)后骨質疏松癥（Postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種全身性的慢性骨骼疾病，對患者有巨大的負面影響。該病所用治療藥物主要分為抑制骨吸收劑與促進骨形成劑［1］，目前臨床治療與科學研究主要集中于減少骨破壞，市面上大多藥物也屬于骨吸收抑制劑［2］，而對于促進骨形成的相關研究較少［3－7］。大量臨床試驗證明，中醫(yī)藥治療PMOP 具有較好的應用前景，因此研究其治療PMOP 的機制，尤其是通過促進骨形成治療PMOP的作用機制有重大意義。

絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，Akt）是一種主要表達在細胞質內的蛋白激酶。目前Akt 的研究重點主要在于脂肪形成，另有研究證實，Akt 亦可以通過影響下游因子PPARγ 的表達，進而調控骨髓間充質干細胞（BMSCs）成脂作用以促進成骨。因而研究Akt 及其下游關鍵因子PPARγ，對于研究PMOP 的治療，尤其是通過促成骨治療PMOP有重要意義。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，培本固疏方（PBGSF）可以調控破骨細胞，本實驗著重研究PBGSF 通過促進成骨干預PMOP 的具體作用機制，以期進一步探索完善PBGSF防治PMOP的有效途徑，從促成骨角度為PMOP的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

6月齡SPF 級（300 ± 30）g 健康雌性未孕大鼠36 只（上海西普爾－必凱實驗動物有限公司），許可證號：SCXK（滬）2018－0006。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學動物實驗中心，室溫（22± 2）℃，濕度40%～60%。本實驗過程由南京中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會監(jiān)督（倫理號：201905A022）。

1.1.2 實驗藥物

培本固疏方由龜甲、鹿角片、人參、仙桃草按2∶2∶3∶4 配伍（所有藥材購于南京中醫(yī)藥大學百草堂藥房），龜甲打碎先煎30 min，加入鹿角片、仙桃草煎煮20 min，過濾煎液，人參單煎30 min 后取汁與前煎液混合，分別濃縮為低、中、高劑量（生藥含量分別為1、2、4 g/mL）冷藏備用。

1.1.3 實驗試劑與設備

1.1.3.1 主要試劑

活性氧（ROS）ELISA 試劑盒（南京翼飛雪生物科技，YFXER00746）；堿性磷酸酶（ALP）ELISA 試劑盒（南京翼飛雪生物科技，YFXER00084－1）；無水乙醇（上海中試化工總公司，2010072312）；二甲苯（濟南匯豐達化工有限公司，9024300）；二抗（Broad Spectrum，85－9043）；DAB 試劑盒（上海生工生物工程有限公司，PW017）；鹽酸（國藥集團化學試劑有限公司，2016082214）；氨水（國藥集團化學試劑有限公司，2016093226）；中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司，2016073021）。

1.1.3.2 主要設備與儀器

脫水機（武漢俊杰電子有限公司，JJ－12J）；包埋機（武漢俊杰電子有限公司，JB－P5）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，RM2016）；凍臺（武漢俊杰電子有限公司，JB－L5）；組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司，KD－P）；烤箱（上?；厶﹥x器制造有限公司，DHG－9140A）；載玻片及蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司，10212432C）；正置光學顯微鏡（日本尼康，NIKONECLIPSE CI）；成像系統(tǒng)（日本尼康，NIKON DS－U3）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組

將全部大鼠隨機分為假手術組、模型組、PBGSF低劑量組（低劑量組）、PBGSF 中劑量組（中劑量組）、PBGSF高劑量組（高劑量組）和西藥組。在自然光條件下分籠飼養(yǎng)，控制室溫（22 ± 2）℃，相對濕度40%～60%。

1.2.2 模型建立

進行1 周的適應性飼養(yǎng)后，采用摘除雙側性腺（卵巢）的方法建立絕經(jīng)后骨質疏松大鼠模型。造模前禁食1 d，飲水正常，術前采用腹腔注射10%水合氯醛溶液（300 mg/kg）對大鼠進行麻醉。造模后7 d 內，各組大鼠均經(jīng)后肢肌注青霉素8 萬U/d 防感染，4 周后經(jīng)骨密度檢測驗證造模是否成功。

1.2.3 給藥

各組大鼠自由飲食、自然光照，每周稱重1 次。造模1 個月后。按等效劑量比率計算各治療組大鼠的給藥劑量并開始灌胃給藥，每日1次，持續(xù)8周，給藥容積0.5 mL/100 g，給藥前將藥劑隔水加熱。低、中、高劑量組分別給予相應生藥含量的培本固疏方；西藥組給予阿侖膦酸鈉0.1 mg/100 g；模型組和假手術組給予生理鹽水0.5 mL/100 g。

1.3 指標檢測

大鼠末次給藥結束禁食1 d 后取材，使用10%水合氯醛溶液經(jīng)腹腔注射（300 mg/kg）對大鼠進行麻醉，后右心室抽血處死。取適量試管并標記組別，仔細快速分離大鼠雙后肢脛骨，置于－80 ℃的冰箱保存，用于Western Blot 檢測；取大鼠股骨組織固定于甲醛溶液，用于骨應力檢測和茜素紅染色；采集大鼠血液保存，用于ELISA檢測。

將待測大鼠脛骨置于MEDIX－90 雙能X 線骨密度儀中，掃描得到高分辨率的圖像，經(jīng)軟件分析測定獲得大鼠脛骨骨密度值（BMD）。用生物力學測試儀進行試驗，檢測骨應力：將取得的股骨標本置于儀器測試口，調整支點使得壓力錘停留于骨標本正中，調整跨距以及加載速度至骨標本斷裂，記錄彈性位移、極限位移和脆性。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對實驗結果進行分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 培本固疏方對去勢大鼠BMD的影響

與假手術組比較，模型組脛骨BMD 顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，低劑量組BMD上升，但結果不具有統(tǒng)計學意義；中劑量組BMD顯著增高（P＜0.05），高劑量組、西藥組BMD 增高十分顯著（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠脛骨BMD情況比較（±s）

表1 各組大鼠脛骨BMD情況比較（±s）

注：與假手術組比較，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

骨密度（g/cm2）0.162±0.037 0.096±0.013##0.125±0.023 0.130±0.018*0.142±0.023**0.149±0.029**組別假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組西藥組n6 6 6 6 6 6

2.2 培本固疏方對去勢大鼠骨應力的影響

與假手術組相比，模型組大鼠股骨組織彈性位移、極限位移明顯低于假手術組（P＜0.01），股骨組織脆性升高（P＜0.05）。與模型組比較，低劑量組極限位移顯著增高，脆性顯著降低（P＜0.01），彈性位移有所增高，但結果不具有統(tǒng)計學意義；中劑量組極限位移顯著增高，脆性顯著降低（P＜0.01），彈性位移結果不具有統(tǒng)計學意義；高劑量組、西藥組彈性位移、極限位移增高均十分顯著（P＜0.01），西藥組脆性降低（P＜0.05），而高劑量組脆性降低更明顯（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠骨生物力學指標的比較（±s，n=6）

表2 各組大鼠骨生物力學指標的比較（±s，n=6）

注：與假手術組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

脆性（mm）0.293±0.079 0.168±0.061#0.287±0.071**0.292±0.077**0.227±0.060*0.270±0.042*組別假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組西藥組彈性位移（mm）0.737±0.120 0.337±0.074##0.304±0.072 0.391±0.079 0.533±0.073**0.571±0.046**極限位移（mm）1.030±0.087 0.505±0.047##0.591±0.035**0.683±0.013**0.760±0.017**0.841±0.015**

2.3 培本固疏方對去勢大鼠骨組織形態(tài)學的影響

用茜素紅（ARS）染色評估OB 礦化程度。與假手術組比較，模型組骨組織未出現(xiàn)鈣化現(xiàn)象。與模型組比較，低、中、高劑量組骨組織鈣化結節(jié)數(shù)量及鈣沉積現(xiàn)象與濃度正相關，西藥組亦可見大量鈣化結節(jié)和鈣沉積。見圖1。

圖1 大鼠股骨組織的形態(tài)學觀察

2.4 培本固疏方對去勢大鼠血清堿性磷酸酶（ALP）的影響

與假手術組相比，模型組大鼠血清ALP 顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，低、中、高劑量組與西藥組大鼠血清ALP 均明顯降低（P＜0.01），其中中藥組效應具有濃度依賴性。見表3、圖2。

表3 各組大鼠ALP水平比較（±s）

表3 各組大鼠ALP水平比較（±s）

注：與假手術組比較，##P ＜0.01；與模型組比較，**P ＜0.01。

組別假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組西藥組ALP（ng/L）33.797±8.170 135.557±11.510##84.677±6.722**71.726±13.135**49.523±13.135**32.872±9.288**n6 6 6 6 6 6

圖2 各組大鼠ALP水平比較

2.5 培本固疏方對去勢大鼠血清活性（ROS）水平的影響

與假手術組相比，模型組大鼠ROS 顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，低、中、高劑量組與西藥組大鼠ROS 均明顯降低（P＜0.01），且中藥組效應具有濃度依賴性。見表4、圖3。

表4 各組大鼠氧化應激指標ROS情況比較（±s）

表4 各組大鼠氧化應激指標ROS情況比較（±s）

注：與假手術組比較，##P ＜0.01；與模型組比較，**P ＜0.01。

ROS（IU/mL）51.536±4.403 185.322±8.309##104.763±15.154**66.162±5.434**50.817±2.972**48.180±2.118**組別假手術組模型組低劑量組中劑量組高劑量組西藥組n6 6 6 6 6 6

圖3 各組大鼠ROS水平比較

2.6 培本固疏方對去勢大鼠Akt/PPARγ 蛋白表達水平的影響

與假手術組相比，模型組大鼠Akt 蛋白表達水平顯著降低，PPARγ 蛋白的表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，低劑量組PPARγ 蛋白的表達水平明顯降低（P＜0.01），Akt 蛋白表達水平增高，但結果不具有統(tǒng)計學意義；中劑量組Akt 蛋白表達水平增高（P＜0.05），PPARγ 蛋白的表達水平降低（P＜0.01）；高劑量組、西藥組Akt 蛋白表達水平顯著增高，PPARγ蛋白的表達水平顯著降低（P＜0.01）。見圖4、圖5、圖6。

圖4 各組大鼠骨組織中堿性磷酸化的Akt蛋白表達情況比較

圖5 各組大鼠骨組織中PPAR－γ蛋白表達情況比較

圖6 各組大鼠骨組織Akt/PPARγ蛋白表達量比較

3 討論

文獻表明，卵巢摘除法是目前普遍用于構建絕經(jīng)后骨質疏松大鼠模型的造模方法，Sprague－Dawley 和Wistar 大鼠是最常用的品系［8］。骨質疏松研究的大鼠最小年齡應為6 個月，故本次實驗選用6 個月大小的SPF 級健康、雌性未孕大鼠，造模結束4 周后經(jīng)骨密度檢測驗證造模成功，后持續(xù)干預給藥8周。

骨密度為目前公認的診斷絕經(jīng)后骨質疏松癥的金指標［9］，而雙能X 線骨密度檢測（DEXA）更是臨床用于評判骨質疏松程度及療效的金指標［10］?，F(xiàn)代研究表明，骨質疏松常伴有明顯骨生物力學改變［11］，因此通過研究骨應力變化，可以在一定程度上反應骨質疏松水平。骨代謝指標的變化先于骨密度，對于骨量的丟失可以起到一定的預測作用，相比較于單獨測定骨密度，進一步測定骨代謝的生化指標可以更為及時地反映骨重建的動態(tài)。

PMOP 是由于激素水平下降等因素，導致絕經(jīng)后婦女骨重塑破壞所形成的疾?。?2－13］。骨形成減少的具體原因在于骨髓間充質干細胞（BMSCs）成骨分化減少以致成骨細胞生成減少，以及氧化應激反應等各種原因導致的成骨細胞凋亡加劇。為了評估培本固疏方對成骨細胞的影響，應當從骨細胞生成的細胞增殖、基質成熟和礦化三個階段分析［14－15］?，F(xiàn)代研究表明，茜素紅（ARS）染色陽性提示成骨細胞礦化成功，各治療組和假手術組ARS 染色均呈陽性，可見大量密集的鈣化結節(jié)和鈣沉積，且低、中、高劑量組骨組織鈣化結節(jié)數(shù)量及鈣沉積現(xiàn)象與濃度正相關，提示培本固疏方可以以劑量依賴的方式促進成骨細胞礦化成熟。此外，堿性磷酸酶（ALP）在骨形成中也起著重要的作用［16－17］，模型組血清中ALP 含量上升，各治療組經(jīng)治療后ALP含量下降，提示培本固疏方可以通過調整血清中ALP水平介導PMOP的治療。

絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine/threonine kinase，Akt）又稱蛋白激酶B，是一種主要表達在細胞質內的蛋白激酶［18］，與骨形成密切相關，具體表現(xiàn)為誘導BMSCs成骨、促進成骨細胞成熟以及抑制骨細胞凋亡三個方面。PPARγ 是Akt 信號通路下游的關鍵影響因子，由細胞內脂質激活，是脂肪細胞分化的重要轉錄因子，對維持脂質穩(wěn)態(tài)和抗氧化/抗炎反應至關重要［19］。PPARγ可以上調BMSCs 成脂作用［20］，進而抑制BMSCs 成骨作用，間接調控成骨細胞的分化和骨形成。Akt/PPARγ通路是調控成骨細胞增殖分化凋亡的關鍵通路，這一途徑可被生長因子和其他細胞外信號激活。在成骨細胞分化和發(fā)揮功能的所有階段都需要Akt 活性［21］，但可能在成骨分化細胞的過程中存在包括PPARγ 在內的幾個不同的Akt 靶標，這些靶標控制著成骨細胞發(fā)育和功能的不同方面［22］，具體如下：

1）Akt/PPARγ 信號通路可以誘導BMSCs 成骨。Akt 本身關系到脂肪形成［23］，有研究表明，在不存在Akt的情況下，脂肪細胞分化受到抑制［24］。當Akt通路受到抑制時，通路下游關鍵因子GSK－3β 和βcatenin 表達上調。現(xiàn)代研究表明，β－catenin 的高表達可以提高BMSCs 成骨分化，而β－catenin 的失活則會導致體內外成骨分化的降低［25］。GSK－3β 失活可以誘導細胞溶質積累，使得β－catenin 易位至細胞核，激活靶基因PPARγ 致其表達上調［26－28］，從而導致脂肪細胞分化，并通過調控BMSCs 成脂作用間接調節(jié)成骨細胞分化，影響骨形成。因此，通過Akt通路調控下游關鍵因子GSK－3β和β－catenin，抑制下游PPARγ表達對于增加BMSC 成骨分化是本課題組自擬方干預PMOP的可能機制。

2）激活Akt/PPARγ 信號通路亦可以促進成骨細胞成熟，機制與Akt 信號通路及其下游關鍵因子Forkhead 轉錄因子（FoxO）有關［29］。FoxO3 為FoxO 家族的主要分子，在軟骨細胞和成骨細胞中高度表達，是Akt信號通路的重要底物［30］。研究表明，F(xiàn)oxO3的缺失會強烈影響成骨細胞的功能［31－34］?；罨腁kt 可以磷酸化FoxO，通過保持其在細胞質中的停留來控制其轉錄活性，通過調節(jié)FoxO3 來影響骨形成和成骨細胞存活，同時可以與骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）協(xié)同介導BMSCs的成骨細胞分化［35］。

3）Akt/PPARγ 信號通路可以控制成骨細胞凋亡，其主要機制與下游骨形成正調控因子FoxO1 有關［36］。氧化應激條件下，活性氧可以通過激活Akt/PPARγ 通路，上調下游關鍵因子Nrf－2［37］表達，以Nrf－2依賴性方式上調HO－1［38－39］表達，抑制細胞凋亡達到其促成骨作用。

以上理論研究得出，激活Akt 通路抑制下游關鍵因子PPARγ 表達，增加成骨細胞分化成熟，減少其凋亡，是本方干預PMOP 的可能機制。本試驗表明，本方可以增加Akt表達，降低PPARγ的表達，這與本方臨床有效性以及對其促成骨作用的猜想相一致。

中醫(yī)學認為，骨質疏松癥的病機多為脾腎不足，氣滯血瘀，治法上?？紤]補益脾腎、活血祛瘀。培本固疏方由郭海英教授根據(jù)長期臨床經(jīng)驗擬定，藥物組成為龜甲、鹿角、人參和仙桃草。其中人參為君藥，固本培元、補脾益氣，以復血瘀日久所致的元氣虛弱，同時補益后天之本，促進水谷精微的運化，充養(yǎng)骨髓；龜甲、鹿角共為臣藥，補益先天，使腎精得復，同時又能溫補腎陽，助推氣血運行；仙桃草為使藥，借君藥人參補氣之力行活血之功，祛陳除瘀，使血瘀得復而骨骼得養(yǎng)?，F(xiàn)代研究亦證實，本方中君藥人參含有大量人參皂苷，人參皂苷Rb1 可顯著提高成骨細胞的成活率和調控ALP，抑制氧化應激，減少ROS，加強骨生成，防治骨質疏松［40］；臣藥鹿角片補益腎陽，適宜濃度的鹿角多肽對BMSCs具有良好的促進作用，可以促進BMSCs 增殖；仙桃草化瘀通絡止痛，其有效成分槲皮素能夠清除體內ROS，維持骨穩(wěn)態(tài)，綠葉酸亦能夠促進BMSCs 增殖和誘導其成骨。臨床癥狀方面，PMOP 常伴隨潮熱、出汗、心痛、失眠等癥狀，這與老年女性的腎陰虛癥狀相似［5］。張介賓曾云：“善補陰者，必于陽中求陰，則陰得陽升而泉源不竭”，方中龜甲亦可以發(fā)揮雌激素替代作用，防止絕經(jīng)后婦女骨質流失，治療PMOP。

4 總結

通過對本實驗結果的分析，可以得出以下結論：

1）培本固疏方能提高BMD，減少骨脆性，增加骨彈性，上調血清中Akt的表達水平，降低ALP、PPARγ的表達，減少細胞氧化應激，說明該方能有效改善絕經(jīng)后骨質疏松，且療效在一定程度上具有劑量依賴性。

2）培本固疏方可以作用于成骨細胞，主要通過發(fā)揮促成骨作用、促進成骨細胞增殖分化以及抗氧化應激減少成骨細胞凋亡防治絕經(jīng)后骨質疏松癥。

3）培本固疏方能調控Akt/PPARγ 信號通路，防治絕經(jīng)后骨質疏松癥。具體機制可能為：①通過Akt 信號通路直接作用于成骨細胞，促進成骨、骨礦化以及成骨細胞增殖分化全過程；②通過調控Akt 信號通路下游關鍵因子PPARγ，降低PPARγ 的表達水平，進而抑制BMSCs 成脂分化，從而間接調節(jié)成骨細胞的增殖和促進骨形成。

本研究通過對培本固疏方干預絕經(jīng)后骨質疏松癥模型大鼠骨相關指標進行檢測，發(fā)現(xiàn)本方防治絕經(jīng)后骨質疏松癥可能與Akt/PPARγ信號通路激活影響骨形成有關。目前，中草藥作用于成骨細胞影響骨形成的研究較少，本研究限于時間和能力，雖基于前期研究結果進一步探索發(fā)現(xiàn)了培本固疏方調控骨形成可能的上游關鍵因子PPARγ 以及Akt 信號通路，但研究工作亦較為粗淺，僅為后續(xù)實驗提出可能性假說。日后若深入探究培本固疏方通過促成骨作用調控骨量這一途徑，仍需繼續(xù)探索本方是否通過其他通路影響骨形成，或本方通過調控Akt 信號通路后又影響哪些因子進而調節(jié)骨形成。且在文獻研究時發(fā)現(xiàn)，本方內基本藥物作用途徑似乎與交感神經(jīng)系統(tǒng)調控骨量有關，仍有待今后進一步學習和探究。