魯博陽 趙 慶 單鏡源 陳向峰 羅振國

佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科（黑龍江 佳木斯 154003）

根治性前列腺切除術(shù)是前列腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但是，在部分病例中，該疾病遵循侵襲性病程，患者具有疾病復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移和與癌癥相關(guān)的死亡[1-2]。前列腺癌中被放松調(diào)節(jié)或與不良結(jié)果相關(guān)的分子標(biāo)志物的鑒定有助于評估潛在的新型治療靶標(biāo)，這可能有助于個體化和改善高?；颊叩闹委焄3-4]。此外，已確定的預(yù)后因素如術(shù)前前列腺特異性抗原水平，但是其無法通過組織學(xué)分級，腫瘤分期，患者年齡和切除余量等臨床因素預(yù)測患者預(yù)后[5]。因此，需要額外的預(yù)后標(biāo)志物來評估個體的預(yù)后情況并計劃個體化治療。已有研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織和癌旁組織有眾多表達(dá)差異蛋白[6]，包括人類抗原R（HuR）和中心體蛋白激酶2（NEK2）。HuR通過與特定的mRNA亞群相互作用，提高了以下蛋白的水平：(1)促進(jìn)細(xì)胞增殖，(2)增加細(xì)胞存活，(3)提高局部血管生成，(4)幫助癌細(xì)胞逃避免疫識別，(5)促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。NEK2參與有絲分裂細(xì)胞中中心體分離和雙極紡錘體形成以及減數(shù)分裂細(xì)胞中染色質(zhì)凝結(jié)控制[8]。NEK2通過磷酸化中心體蛋白，如CROCC,CEP250和NINL，調(diào)節(jié)中心體分離，導(dǎo)致它們從中心體移位。但是HuR和NEK2對前列腺癌的臨床價值尚不明確?；诖?，本研究探討人類抗原R(HuR)、中心體蛋白激酶2（NEK2）在前列腺癌及其癌旁組織中的表達(dá)及其臨床價值。

資料與方法

一、一般資料

納入2018年1月-2021年1月我院收治的前列腺癌患者95例為惡性腫瘤組，其中，大于等于60歲的有43例，小于60歲的有52例，平均年齡（55.32±13.32）歲；有家族史45例，無家族史50例；腫瘤最大徑大于等于5cm有58例，小于5cm有37例；組織學(xué)分級：G1和G2期共有34例，G3期有61例；精囊腺侵犯57例；臨床分期：A和B期共有46例，C和D期共有49例。所有患者先前均已通過對從原發(fā)灶獲取的活檢樣品進(jìn)行組織病理學(xué)分析而診斷為前列腺癌。同時納入2018年1月-2021年1月我院收治的前列腺增生患者69例為良性組，平均年齡（52.45±11.39）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重心、肝、腎功能損害者；②服用過內(nèi)分泌藥物者；③患有其他腫瘤者；④患有精神疾病者。各組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），可納入此次分析。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批，受試者均簽署知情同意書。

二、免疫組織化學(xué)

將手術(shù)所得的組織進(jìn)行包埋和切片。將載玻片脫蠟，再水化，浸入3%過氧化氫溶液中15分鐘，在檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）中于95℃加熱25分鐘，然后于室溫冷卻60分鐘。在每個孵育步驟之間，將切片用PBS（pH 7.4）洗滌。將載玻片用10%正常山羊血清在37℃下封閉30分鐘，洗滌并在4℃下與抗HuR小鼠單克隆抗體（ab242410，abcam公 司），NEK2兔多克隆抗體（ab115731，abcam公司）結(jié)合。沒有添加一抗的玻片用作陰性對照。用PBS洗滌后，按照制造商的說明使用PV-9000聚合物檢測系統(tǒng)對玻片進(jìn)行可視化，然后用蘇木精復(fù)染。

三、總RNA抽取與實時熒光定量PCR

通過TRIzol試劑（Ambion）從組織中提取總RNA。按照制造商的說明，通過GoScript逆轉(zhuǎn)錄（RT）系統(tǒng)（Promega）將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）用于通過Mx3005P實時PCR系統(tǒng)（Stratagene）上的GoTaq qPCR Master Mix（Promega）檢測HuR,NEK2,GAPDH水平。所有結(jié)果均表示為三個獨(dú)立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

使用Python中pandas package進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。使用t檢驗比較連續(xù)變量。Chi-square檢驗分析NEK2和HuR與前列腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性。應(yīng)用受試者工作特征（ROC）曲線下面積（AUC）分析HuR和NEK2 mRNA水平對區(qū)分前列腺癌患者臨床病理特征的效能。P＜0.05的差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、前列腺癌患者癌組織和癌旁組織中HuR和NEK2的表達(dá)水平

腫瘤組癌組織中HuR和NEK2的表達(dá)陽性率均高于良性組前列腺增生組織，見表1。腫瘤組癌組織中HuR和NEK2的蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平均高于癌旁組織，見圖1和圖2。

表1 良性組和惡性腫瘤組中HuR和NEK2的表達(dá)陽性率

圖1 前列腺癌患者癌組織和癌旁組織中HuR和NEK2的蛋白表達(dá)水平

圖2 前列腺癌患者癌組織和癌旁組織中HuR和NEK2的mRNA表達(dá)水平

二、HuR和NEK2與前列腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

腫瘤組癌組織中HuR和NEK2的陽性表達(dá)與年齡、家族史無關(guān)（P＞0.05），而與腫瘤最大徑、組織學(xué)分級、精囊腺侵犯、臨床分期具有相關(guān)性（P＜0.05），見表2。

表2 HuR與NEK2與前列腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

三、HuR和NEK2 mRNA水平對區(qū)分前列腺癌患者臨床病理特征的效能

為了評估HuR和NEK2 mRNA水平在前列腺癌患者臨床病理特征中的診甄別效能，將95例前列腺癌患者癌組織中HuR和NEK2 mRNA進(jìn)行ROC分析。HuR mRNA水平在區(qū)別腫瘤最大徑、組織學(xué)分級、精囊腺侵犯、臨床分期有相關(guān)性的靈敏度分別為85%、92%、80%、86%，特異度分別為78%、82%、83%、78%。NEK2 mRNA水平在區(qū)別腫瘤最大徑、組織學(xué)分級、精囊腺侵犯、臨床分期有相關(guān)性的靈敏度分別為87%、89%、80%、83%，特異度分別為83%、85%、85%、82%，見表3。

表3 HuR和NEK2 mRNA水平與前列腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

討 論

前列腺癌是威脅男性健康的最常見的惡性腫瘤之一[7]。2012年，全世界大約有110萬人被診斷出患有前列腺癌[8]。據(jù)統(tǒng)計，美國每年約有220,800例新的前列腺癌病例，占男性惡性腫瘤的1/42。近年來，中國前列腺癌的發(fā)病率大大增加了[9]。盡管前列腺癌的篩查，診斷和治療技術(shù)取得了顯著發(fā)展，但其死亡率仍然很高[10]。主要原因是前列腺癌是一種典型的異質(zhì)性疾病，其癥狀不明顯且進(jìn)展緩慢。但是，也有一些前列腺癌患者癥狀會迅速發(fā)展，并且可能會轉(zhuǎn)移到骨骼或其他器官，最終導(dǎo)致相對較高的死亡率[11]。因此，迫切需要一些新的生物標(biāo)志來指征前列腺癌的臨床特征。

在本研究中，發(fā)現(xiàn)腫瘤組受試人員癌組織中HuR和NEK2的表達(dá)陽性率均高于良性組受試人員前列腺增生組織（P＜0.05）。腫瘤組癌患者癌組織中HuR和NEK2的蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平均高于癌旁組織（P＜0.05）。提示HuR和NEK2的蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平可能成為新的前列腺癌特征的標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者癌組織中HuR和NEK2的陽性表達(dá)與年齡因素、家族史因素?zé)o關(guān)（P＞0.05），而與腫瘤最大徑、組織學(xué)分級、精囊腺侵犯、臨床分期有相關(guān)性（P＜0.05）。HuR是RNA結(jié)合蛋白Hu家族的成員，在許多細(xì)胞類型中普遍表達(dá)。HuR識別并結(jié)合含有腺苷和富含尿嘧啶元素的mRNA[12]。這些元素經(jīng)常出現(xiàn)在幾種不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄本的3'非翻譯區(qū)域，這些轉(zhuǎn)錄本編碼細(xì)胞因子，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子或原癌基因。HuR與mRNA的結(jié)合穩(wěn)定了mRNA，并防止其被核酸外切酶快速降解[13]。因此，HuR可能是提高了促腫瘤發(fā)生發(fā)展中重要蛋白的mRNA的穩(wěn)定性來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。NIMA相關(guān)激酶2（NEK2）是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白激酶家族的成員，屬于中心體相關(guān)蛋白激酶[14]。相關(guān)研究的學(xué)者發(fā)現(xiàn)了間期和有絲分裂期[15]。此外，大量研究表明，NEK2表達(dá)在多種腫瘤中異常升高[16]。此外，NEK2異常涉及惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的許多環(huán)節(jié)[17]。提示NEK2可以作為治療人類惡性腫瘤的潛在靶標(biāo)。HuR mRNA水平在區(qū)別腫瘤最大徑、組織學(xué)分級、精囊腺侵犯、臨床分期相關(guān)性的靈敏度分別為85%、92%、80%、86%，特異度分別為78%、82%、83%、78%。NEK2 mRNA水平在區(qū)別腫瘤最大徑、組織學(xué)分級、精囊腺侵犯、臨床分期有相關(guān)性的靈敏度分別為87%、89%、80%、83%，特異度分別為83%、85%、85%、82%，顯示了HuR和NEK2 mRNA水平較好的區(qū)分效能。

綜上所述，HuR和NEK2在前列腺癌組織中呈高陽性，與腫瘤最大徑、組織學(xué)分級、精囊腺侵犯、臨床分期有相關(guān)性，可作為前列腺癌患者臨床病理特征診斷和預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)記分子。