劉勝京 杜冠潮 高慶和 張繼偉 晏 斌 趙 豐 郭 俊 郭 軍

中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院男科（北京 100091）

良性前列腺增生癥 （benign prostatic hyperplasia,BPH）俗稱前列腺增生，是以前列腺中葉增生為實質改變，突入膀胱或尿道內，壓迫膀胱頸部或尿道，從而引起下尿路梗阻的一組癥候群，主要表現(xiàn)為尿頻、尿急和進行性排尿困難等癥狀，是中老年男性的常見病與多發(fā)病[1]。BPH在中醫(yī)屬于“癃閉”范疇，在《素問·宣明五氣》云：“膀胱不利為癃”，主因膀胱氣化不利或氣化無權所致，病位主要在腎與膀胱，涉及三焦、肺、脾、肝，其中脾腎虛衰為重要病因之一[2]。

前列舒樂顆粒是由淫羊藿、黃芪、蒲黃、車前草、川牛膝5味藥材組成的上市中成藥，具有補腎益氣，化瘀通淋的功效，可用于腎脾雙虛、氣滯血瘀之BPH及慢性前列腺炎的治療[3]。目前臨床研究結果表明，前列舒樂顆粒對于BPH具有較好的治療效果。但是，前列舒樂顆粒作為中藥復方制劑，其所含活性成分較多，目前對其治療BPH的機制研究匱乏，不能從整體上反應其多成分、多靶點治療BPH的作用特點，因此需要一項新的藥理學研究思路，從整體角度對前列舒樂顆粒治療BPH的作用機制進行全面分析。

網絡藥理學是基于復雜網絡關系研究藥物治療機制的一種手段，符合中藥治療疾病多靶點的思路，因此將網絡藥理學與中藥作用機制研究相結合具有較好的優(yōu)勢及潛力。本研究以前列舒樂顆粒復雜化學成分為研究對象，運用網絡藥理學和生物信息學技術等方法預測前列舒樂顆粒有效成分的作用靶點，深入探討前列舒樂顆粒治療BPH的作用機制。

材料與方法

一、前列舒樂顆粒藥物活性成分的篩選

應用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺[4]（TCMSP，http://tcmspw.com）及中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺[5](TCMIP,http://www.tcmip.cn)收集前列舒樂顆粒中淫羊藿、黃芪、蒲黃、車前草、川牛膝的化學成分。以ADME參數(shù)中的口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18為限制條件進行篩選，并在PubMed及中國知網查閱相關藥物化學成分研究或綜述文章進行檢驗，補充未納入的重要成分，最后依據目前基于HPLC、LC/MS等方法已經鑒定出的前列舒樂顆粒成分進行比對補充，構建前列舒樂顆粒的活性成分數(shù)據庫，并在PubChem數(shù)據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）確認其分子結構。

二、藥物活性成分作用靶點及疾病靶點的獲取

通過pharmmaper數(shù)據庫（http://www.lilab-ecust.cn），獲得活性成分最相關的靶點信息。利用GeneCards、OMIM數(shù)據庫搜索疾病的靶點，關鍵詞設置為“benign prostatic hyperplasia”，獲得與BPH相關的疾病靶點。

三、藥物靶點與疾病靶點相映射

利用R軟件，將上述得到的藥物靶點與疾病相關靶點相映射，得到前列舒樂顆粒治療BPH的潛在作用靶點。

四、靶點間相互作用分析

將映射后得到的藥物與疾病的共同靶點導入STRING平臺（https://string-db.org），構建靶點間蛋白互作網絡（protein-protein interaction，PPI），選取最低相互作用閾值大于0.9的數(shù)據，獲得PPI網絡文件，將節(jié)點信息node與combined score值導入Cytoscape軟件，計算節(jié)點與節(jié)點之間相互作用值（degree值）并進行圖形化展示，獲得最終PPI網絡圖。

五、基因本體與通路富集分析

利用R軟件通過基因本體(Gene Ontology，GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)對核心靶點進行生物學過程及作用通路分析，并將結果以氣泡圖及圈圖的形式呈現(xiàn)。

六、“藥物-活性成分-作用靶點-富集通路”可視化網絡圖構建

根據上述分析得到的藥物活性成分、作用靶點及核心信號通路，利用Cytoscape軟件構建前列舒樂顆?！八幬?活性成分-作用靶點-富集通路”的可視化網絡圖。

結 果

一、篩選的前列舒樂顆粒藥物活性成分

基 于TCMSP、TCMIP數(shù) 據 庫，以OB≥30%且DL≥0.18為標準對前列舒樂顆粒藥物成分進行篩選，共得到65個化學成分，其中來源于淫羊藿23個、黃芪20個、蒲黃8個、車前草10個、川牛膝4個。通過進一步閱讀文獻及依據目前基于HPLC、LC/MS等方法已經鑒定出的前列舒樂顆粒成分[6-8]，黃芪中的黃芪甲苷（astragalosideⅣ），蒲黃中的香蒲新苷（typhaneoside）、異鼠李素-3-O-新橙皮苷（Isorhamnetin-3-O-neohesperidoside），車前草的大車前苷（plantamajoside），川牛膝中的杯莧甾酮（cyasterone），雖然OB或DL值較低，但均已被證實為相關藥物的主要活性成分，因此也被納入潛在的活性成分進行分析。最終確定復方中共70個潛在活性成分，其中，淫羊藿、黃芪、蒲黃、車前草、川牛膝的潛在活性成分個數(shù)分別為23、21、10、11、5。

二、獲取的藥物活性成分作用靶點及疾病靶點

通過pharmmaper數(shù)據庫獲得藥物的相關靶點，去重后共得到相關靶點134個。通過GeneCards、OMIM數(shù)據庫獲得與BPH相關靶點共868個。

三、藥物靶點與疾病靶點相映射

利用R軟件，將上述得到的134個前列舒樂顆粒的藥物靶點與868個與BPH相關度較高的疾病靶點相映射，得到61個前列舒樂顆粒治療BPH的潛在作用靶點。

四、靶點間相互作用分析

將映射后得到的藥物與疾病的共同靶點導入STRING平臺，選取最低相互作用閾值大于0.9的數(shù)據，經Cytoscape處理后得到PPI蛋白互作網絡，見圖1。圖中節(jié)點的大小和顏色深淺反映節(jié)點之間degree值的大小，顏色越深表示節(jié)點之間關系越強；節(jié)點之間的連線粗細反映了結合率評分（combined score）的大小，連線越粗表示節(jié)點結合率越高。通過PPI互作網絡分析，可見蛋白互作頻次最高的為腫瘤抑制基因（TP53），其次激素受體如雄激素受體（AR）、雌激素受體（ESR1）、糖 皮 質激素受體（NR3C1），5α還原酶（SRD5A），腎上腺素能受體Alpha1A（ADRA1A），生長因子相關受體（EGFR、ERBB2）、炎癥相關受體（RELA、IL6）、核蛋白轉錄因子（FOS）、特異性周期蛋白（CCND1）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK8）、核受體輔激活蛋白基因（NCOA1）、凋亡信號相 關分子（CASP3、CASP8、MYC）等，是整個網絡的節(jié)點蛋白。

圖1 共同靶點蛋白互作網絡

五、基因本體與通路富集分析

（一）核心靶點GO富集分析 對核心靶點進行GO分析，即從生物過程（biological process,BP）、細胞組分（cellular component,CC）和分子功能（molecular function,MF）對基因功能進行注釋，以顯著性（P）＜0.05、錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05為條件篩選，發(fā)現(xiàn)核心基因主要富集在1285個BP、23種CC和92種MF。前列舒樂顆粒治療BPH的生物學過程包括類固醇激素反應、氧化應激反應、凋亡信號通路調節(jié)以及對酮、金屬離子及紫外線的反應等；這些靶點在細胞組分中與膜閥、膜微孔、膜受體、核染色質及轉錄因子復合物、激酶復合物有關；在分子功能中與蛋白連接酶、轉錄因子活性、核受體活性、類固醇結合相關度較大。分別列出BP、CC、MF排名前10的富集結果，見圖2。圖中柱狀圖的高度代表富集的靶點數(shù)目，顏色深淺代表富集的顯著程度，顏色越紅代表顯著程度越高。

（二）核心靶點KEGG富集分析 對核心靶點進行KEGG富集分析，篩選條件同GO分析，共得到112條具有顯著意義的通路，這些通路主要與前列腺癌、細胞凋亡、內分泌抵抗等相關通路有關，查閱文獻后挑選與BPH相關度較大的10條通路，并與相關基因進行對應，繪制圈圖分析，見圖3。圖中圓圈左半部分為與通路有關的基因；右半部分為與BPH相關度較高的通路；圓圈中間的線為通路與基因的對應關系。因目前實驗研究多從信號通路進行探討，研究方法更為成熟，可操作性更強，故剔除疾病及廣義通路后，得到10條相關度最高的信號通路，納入網絡圖分析，見圖4。

圖2 核心靶點GO富集分析氣泡圖

六、“藥物-活性成分-作用靶點-富集通路”可視化網絡圖構建

基于復雜網絡展現(xiàn)前列舒樂顆粒中“藥物-活性成分-作用靶點-富集通路”之間的關系，見圖4。圖中正方形代表藥物，菱形代表藥物活性成分，圓形代表作用靶點，箭形代表預測與BPH相關度較高的信號通路；顏色與大小根據degree值決定，顏色越深、形狀越大代表節(jié)點之間的關系越強，在網絡圖中的地位越重要。在圖4中可以看出，左側菱形部分為前列舒樂顆粒藥物治療BPH的主要活性成分，分為君藥（淫羊藿）、臣藥（黃芪）、佐使藥（蒲黃、車前草、川牛膝）以及藥物相同成分四個部分來表示，體現(xiàn)了中醫(yī)藥配伍中“君臣佐使”的配伍關系；中間圓形部分為前列舒樂顆粒治療BPH的預測靶點；右側箭形部分為前列舒樂顆粒治療BPH潛在相關度較高的信號通路。

圖3 核心靶點KEGG富集分析圈圖

討 論

傳統(tǒng)中藥復方的機理研究多針對某單一通路，通過實驗手段逐一篩選作用靶點，存在選擇較為主觀及效率低下等問題，且中藥復方成分較多，往往不是單一對應關系，因此中藥復方的機制研究適合從整體上把握其之間的網絡關系。本研究基于網絡藥理學及生物信息學等研究方法，對前列舒樂顆粒進行深入研究，為藥物的動物實驗及進一步產品研發(fā)提供了較好的思路，同時也為臨床多靶點、多通路的復方研究提供借鑒。

本研究經數(shù)據庫篩選得到前列舒樂顆粒的70個主要活性成分及134個作用靶點，與BPH作用靶點相映射后，得到61個藥物治療疾病的潛在靶點，說明前列舒樂顆粒治療BPH覆蓋范圍較廣。通過前列舒樂顆粒藥物分析及圖4的網絡圖，可以看出其君藥淫羊藿中的淫羊藿苷與臣藥黃芪中的毛蕊異黃酮（Calycosin）在網絡中均發(fā)揮重要作用。涂梅琳等[9]發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷對增生的前列腺組織有明顯抑制作用，且與劑量成正相關關系。而黃芪改善BPH的相關癥狀已有臨床研究[10]，動物實驗發(fā)現(xiàn)其可明顯逆轉大鼠前列腺組織增生[11]，而作用機理可能為毛蕊異黃酮可降低血清中睪酮和二氫睪酮的濃度[12]。從圖4中可以看出，槲皮素為網絡中重要節(jié)點，一項隨機雙盲臨床試驗證明槲皮素對減輕BPH癥狀，增加尿流率有較好的效果[13]。通過藥物成分及網絡圖分析，可以看出君藥及臣藥藥少力專，在網絡圖中發(fā)揮主要作用，佐使藥既輔助君藥及臣藥協(xié)同發(fā)揮作用，又有各自靶點獨立針對疾病發(fā)揮作用，藥物之間展示了良好的“君臣佐使”配伍關系。

目前關于BPH的發(fā)病機制主要有雌/雄激素對前列腺細胞增殖和凋亡的調控，上皮與基底細胞相互作用，生長因子作用以及炎癥等[14-15]。通過PPI網絡分析顯示，在網絡中處于重要節(jié)點位置的雄激素受體（AR）、雌激素受體、5α還原酶，α1型腎上腺素能受體、表皮生長因子受體及炎癥相關受體（RELA、IL6）等均已有相關研究證明與BPH有關[16-18]。前列腺為雄激素依賴性器官，而睪酮作為最重要的雄激素，可直接與AR結合產生生物活性，此外睪酮還可以與5α還原酶受體結合，被轉化為活性更強的雙氫睪酮促使前列腺的增生，因此抑制5α還原酶可減輕BPH的相關癥狀。并且有研究顯示，睪酮和雙氫睪酮的轉化及與AR的結合會發(fā)生受體配體復合物的核轉位，同時招募其它輔助調節(jié)因子如NCOA1等與靶基因上的AR反應原件結合，共同調控靶基因的表達。前列腺及膀胱頸平滑肌內均有α受體分布，增生組織高于正常組織，且以α1A受體為主，其遞質去甲腎上腺素釋放增加致平滑肌張力增強，膀胱頸及尿道內壓力增高，排尿阻力增加，引起下尿路梗阻癥狀。通過網絡藥理學預測前列舒樂顆粒治療BPH的相關生物活動的機制，分析結果與既往BPH發(fā)病機制吻合度高。前列舒樂顆?？赡芡ㄟ^抑制α受體活性，舒張尿道平滑肌張力，減輕膀胱頸及尿道內壓力。同時抑制5α還原酶活性，調節(jié)血清及前列腺組織睪酮雙氫睪酮水平，降低血清及前列腺組織睪酮及雙氫睪酮含量、增加雌激素含量，抑制前列腺血管增生等途徑來起到治療BPH的作用。

KEGG通路分析較顯著的通路有前列腺癌通路、細胞凋亡通路、內分泌抵抗通路，相關激素通路如雄激素信號通路、雌激素信號通路、催乳素信號通路、甲狀腺激素信號通路以及PI3K-Akt、MAPK、p53、TNF等通路，與已有BPH研究吻合度較高。PI3K-AKT信號通路調節(jié)細胞生長、分化、增殖與代謝等多種生物學過程，與細胞生存及細胞分裂密切相關，通路激活后，使其底物發(fā)生磷酸化，并與蛋白結合發(fā)揮抑制細胞凋亡與促進細胞增殖的作用[18]。有動物實驗研究，阻斷PI3K-Akt信號通路具有抑制前列腺增生的作用[20,21]。MAPK信號通路是將信號從細胞表面?zhèn)鬟f到細胞核內部的重要環(huán)節(jié)，其基于磷酸化的信號形式進行三級激酶模式傳導，與免疫相關疾病、組織器官纖維化、個體發(fā)育、組織器官再生及癌癥發(fā)生發(fā)展等密切相關。有研究表明，p38MAPK通路的活化參與了前列腺上皮和間質增生的調控，在細胞增殖過程中引起生長因子及雄激素的缺乏，導致去除效應從而激活p38通路，促進細胞凋亡以抵抗前列腺增生[22,23]。而PI3K-AKT與MAPK信號通路存在相互作用關系[24]，p38MAPK及PI3K-AKT通路可進一步聯(lián)合分析以探究前列舒樂顆粒治療BPH的作用機制。

本研究通過網絡藥理學及生物信息學的分析方法，預測了前列舒樂顆粒治療BPH的作用機制，體現(xiàn)了前列舒樂顆粒治療BPH多成分、多靶點、多途徑的治療特點。本研究主要成分通過TCMSP及TCMIP篩選后進行文獻校對，并經HPLC、LC/MS等實驗方法確認其成分，藥物作用靶點通過PharmMapper服務器基于反向分子對接方法進行預測，相比于僅依據數(shù)據庫檢索成分及根據分子二維結構相似性尋找靶點，預測結果更為準確，為進一步實驗驗證提供了更強有力的理論依據。