薛競(jìng)東 俞仲偉 馮 超 謝 弘 李 鋒 王田龍 汪祖林**

1.上海市第八人民醫(yī)院（上海市第六人民醫(yī)院徐匯分院）泌尿外科（上海 200235）2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院泌尿外科（上海 200233）

下泌尿道纖維化，尤其是膀胱頸部纖維化、尿道狹窄、陰莖海綿體硬結(jié)癥等在治療上較為棘手，技術(shù)要求高，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，所以對(duì)相關(guān)疾病發(fā)生的病因機(jī)制研究在臨床上是急需解決的課題之一。臨床上治療處理集中在改變大體解剖結(jié)構(gòu)層面，雖技術(shù)和方法不斷更新[1-2]，但療效往往不令人滿意，且疾病容易復(fù)發(fā)，究其原因主要是目前研究集中在組織工程修復(fù)，而對(duì)相關(guān)疾病本身發(fā)生、發(fā)展機(jī)制認(rèn)識(shí)尚無(wú)明確定論，缺乏有效的措施防止疾病發(fā)生以及阻止術(shù)后復(fù)發(fā)。目前有研究認(rèn)為雄激素參與心血管纖維化、肺纖維化等病理進(jìn)展[3-4]。在泌尿系統(tǒng)相關(guān)疤痕纖維化形成過(guò)程中，主要為成纖維細(xì)胞等參與的過(guò)度修復(fù)造成，而在其中微環(huán)境中高雄激素可能扮演重要的角色。本研究擬通過(guò)目前較為熱門的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)深度分析雄激素處理人包皮成纖維細(xì)胞后差異性表達(dá)變化及其相關(guān)信號(hào)通路的影響。

材料與方法

一、主要細(xì)胞系及試劑

人包皮成纖維細(xì)胞系HFF-1細(xì)胞購(gòu)自中科院細(xì)胞干細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Trizol試劑盒購(gòu)自上海普飛公司、M-MLV試劑盒購(gòu)自美國(guó)promega公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞用含15%胎牛血清，1%雙抗（青鏈霉素混合液）的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。顯微鏡下觀察97H細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞率達(dá)95%以上。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HFF-1細(xì)胞用胰酶消化后以50萬(wàn)細(xì)胞/孔的密度接入細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，貼壁培養(yǎng)24小時(shí)后，吸棄原有培養(yǎng)基，貼壁的HFF-1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

三、R NA提取和測(cè)序

HFF-1接種于6孔板中，實(shí)驗(yàn)分為兩組：加等體積濃度0.5%乙醇（control組，下稱Ctrl組）與等體積含濃度0.5%乙醇的80nmol/L雙氫睪酮處理（drug組，下稱Drug組），每組3個(gè)復(fù)孔，6h后收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，并進(jìn)行質(zhì)量控制。按照美國(guó)Illumina生物技術(shù)公司RNA-seq樣本制備試劑盒說(shuō)明構(gòu)建cDNA文庫(kù)。對(duì)照基因組信息和完整的轉(zhuǎn)錄組信息，將測(cè)序出的reads比對(duì)到參考基因組上，進(jìn)而對(duì)基因或轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行注釋和定量。將reads比對(duì)到基因組后，采用StringTie（2016）對(duì)表達(dá)進(jìn)行注釋和定量。StringTie應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)流算法和可選的基因組denovo組裝，將復(fù)雜的數(shù)據(jù)集組裝成轉(zhuǎn)錄本。進(jìn)一步計(jì)算基因和轉(zhuǎn)錄本的FPKM值（Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragment，即每百萬(wàn)外顯子片段堿基映射獲得的基因表達(dá)）。

四、差異轉(zhuǎn)錄本分析

利用Ballgown對(duì)兩個(gè)不同處理組進(jìn)行比較，得到P值、Q值和轉(zhuǎn)錄本間的差異倍數(shù)（fold-change）；本研究中將兩組進(jìn)行比較，進(jìn)行差異基因篩選，篩選條件為P＜0.05和Fold change＞1.5倍及＜0.66667倍。

五、GO功能類別及通路富集分析

GO數(shù)據(jù)庫(kù)（gene ontology）用樹狀分層的方式對(duì)基因及蛋白功能進(jìn)行詳細(xì)描述，闡明了基因功能之間的層次關(guān)系。并將基因功能分為：分子功能（MF；molecular function）、生物學(xué)過(guò)程（BP；biological pathway）和細(xì)胞成分（CC；cellular component）3個(gè)類別。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是系統(tǒng)分析基因及其編碼產(chǎn)物間關(guān)系、基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，信號(hào)通路分析（Pathway分析）是基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)差異基因利用Fisher精確檢驗(yàn)和檢驗(yàn)，將目標(biāo)基因參與的通路進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，按照P＜0.05進(jìn)行篩選，篩選出顯著性差異的信號(hào)通路。

六、定量PCR驗(yàn)證

將測(cè)序的RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果中代表性的差異表達(dá)基因（GJA1、JUN、SMAD3、KRT18）進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證，通過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證，定量PCR使用SYBR Premix ExTaq進(jìn)行分析，目的基因的mRNA表達(dá)量均以β-actin作為內(nèi)參，用2-△△Ct最小二乘法進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)樣本重復(fù)3個(gè)復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，以保證結(jié)果的穩(wěn)定性。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad 7.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RNA-seq聚類分析結(jié)果

由基因火山圖（圖1）可直觀展示每個(gè)比較組合的差異基因分布情況，通過(guò)對(duì)兩個(gè)處理組進(jìn)行比較，得到26573個(gè)基因無(wú)差異化表達(dá)，688個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因414個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因274個(gè)。圖中橫坐標(biāo)表示基因在兩組中的表達(dá)倍數(shù)變化值（log2Fold-Change值），縱坐標(biāo)表示基因在兩組中表達(dá)差異的顯著性水平(-log10padj)，數(shù)值越大，差異性越明顯。

圖1 基因火山圖

二、差異基因顯著富集的GO分析結(jié)果

根據(jù)分析結(jié)果中差異基因的顯著性水平構(gòu)建分布圖（圖2），可見在分子功能（BP）、生物學(xué)過(guò)程（CC）和細(xì)胞成分（MF）3個(gè)類別基因中，顯著改變功能基因主要富集于：細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外成分、血管新生；細(xì)胞遷移及運(yùn)動(dòng)的正調(diào)控脈管系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)節(jié)；膠原代謝過(guò)程、低氧反應(yīng)、細(xì)胞-基質(zhì)粘附；上皮細(xì)胞增殖遷移、傷口愈合等。

圖2 GO富集分析柱狀圖

三、差異表達(dá)基因的通路顯著性富集分析結(jié)果

由圖3可見，通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析，上調(diào)基因明顯富集于細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)及細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的信號(hào)通路：黏著斑（Focal adhesion）通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用（ECM-receptor interaction）通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路等，此外還與趨化因子信號(hào)通路、補(bǔ)體途經(jīng)（Complement and coagulation cascades）、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)信號(hào)通路有關(guān)，說(shuō)明雄激素刺激成纖維細(xì)胞后可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào)及炎癥信號(hào)通路發(fā)生改變。

圖3 KEGG富集分析柱狀圖

四、定量PCR驗(yàn)證結(jié)果

由圖4可見，通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果中代表性的差異表達(dá)基因 （GJA1、JUN、SMAD3、KRT18）進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果完全一致，睪酮處理成纖維細(xì)胞后能顯著抑制GJA1和JUN基因的表達(dá)，顯著增強(qiáng)SMAD3和KRT18基因的表達(dá)，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 各基因qPCR驗(yàn)證表達(dá)散點(diǎn)圖

討 論

泌尿系統(tǒng)組織、器官纖維化，尤其是尿道狹窄纖維疤痕化的臨床基礎(chǔ)研究較為熱門，但其病理機(jī)制研究仍相對(duì)薄弱，基于目前的研究，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其主要病理機(jī)制為成纖維細(xì)胞、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用，并通過(guò)多種細(xì)胞因子以及趨化因子參與發(fā)揮作用，調(diào)控著成纖維細(xì)胞的增殖與代謝，延緩上皮細(xì)胞的修復(fù)重建，影響細(xì)胞外基質(zhì)的形成與降解，最終導(dǎo)致創(chuàng)面過(guò)度修復(fù)，產(chǎn)生增生性瘢痕，進(jìn)而破壞原組織完整性，造成疤痕的形成[5]。目前針對(duì)該種疾病的研究暫無(wú)特定的對(duì)應(yīng)細(xì)胞系，多數(shù)研究者均采用臨床獲取的尿道等疤痕組織分離純化的成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)后進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，缺乏一定的可重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)原則，鑒于上述考量，結(jié)合目前研究報(bào)道情況，選用靠近尿道組織的較為成熟的人包皮成纖維細(xì)胞系（HFF-1）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象[6]。

睪酮是雄性動(dòng)物體內(nèi)最主要的雄性激素。多項(xiàng)研究證實(shí)睪酮對(duì)血管活性物質(zhì)、炎癥因子等均有不同程度的影響。Foresta等[3]研究證實(shí)睪酮可通過(guò)雄激素受體途徑促進(jìn)骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移與增殖，進(jìn)而減少動(dòng)脈硬化疾病的發(fā)展。另有報(bào)道睪酮可以通過(guò)ERK1/2通路影響心肌成纖維細(xì)胞的膠原合成和增殖過(guò)程[7]。最新的研究顯示在前列腺腫瘤領(lǐng)域內(nèi)，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞通過(guò)胞膜雄激素受體途徑調(diào)控分泌干擾素等細(xì)胞因子參與并影響周圍腫瘤干細(xì)胞活性[8]。在一項(xiàng)回顧性研究中，從1200例接受尿道成形術(shù)的患者選取11例典型病例，將他們分為正常雄激素組和低雄激素組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組中低雄組患者術(shù)中取得的尿道狹窄疤痕組織的雄激素受體更低，而尿道萎縮壞死率更高，這可能與組織血管化程度低下、缺氧程度高有一定的關(guān)系[9]。雖雄激素及其受體在男科領(lǐng)域研究較為普及，多數(shù)應(yīng)用于前列腺增生及前列腺腫瘤的治療方案上，但其在泌尿生殖器官纖維化領(lǐng)域，尤其是男性尿道狹窄疤痕形成，海綿體纖維化，陰莖硬結(jié)癥等方面機(jī)制機(jī)理研究目前仍較少涉及。

RNA高通量測(cè)序技術(shù)又稱為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，通過(guò)高通量測(cè)序手段檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mRNA水平[10]。測(cè)序的流程大致為提取總RNA，根據(jù)不同的樣本進(jìn)行RNA片段化，再反轉(zhuǎn)錄得到cDNA后通過(guò)接頭連接和PCR擴(kuò)增進(jìn)行高通量的測(cè)序，通過(guò)評(píng)估得出基因組的表達(dá)豐度，并進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，通過(guò)生信軟件GO分析和KEGG分析進(jìn)行差異基因分門分類，得出相關(guān)信號(hào)通路。目前該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床和基礎(chǔ)研究，尤其在腫瘤領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[11-12]。

我們的研究通過(guò)RNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了雄激素對(duì)HFF-1細(xì)胞引起的基因表達(dá)改變的影響，根據(jù)RNA-seq結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，雄激素處理后能夠顯著降低相關(guān)纖維化保護(hù)性基因的表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)及細(xì)胞增殖炎癥基因表達(dá)，改變細(xì)胞外基質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)分布，調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞遷移能力及其分泌膠原蛋白的細(xì)胞功能。在本實(shí)驗(yàn)生信分析中發(fā)現(xiàn)雄激素處理后黏著斑（Focal adhesion）通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用（ECM-receptor interaction）通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等均發(fā)生明顯變化，這些經(jīng)典通路可能參與了細(xì)胞纖維化的整個(gè)過(guò)程。以GJA1，JUN基因?yàn)榇淼南嚓P(guān)通路基因在雄激素處理組中表達(dá)顯著下降，這可能是纖維化病理過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞凋亡信號(hào)失調(diào)的原因之一，說(shuō)明高雄激素的環(huán)境影響可以打亂正常的修復(fù)過(guò)程，進(jìn)而導(dǎo)致疤痕進(jìn)展的重要因素。此外，雄激素能夠顯著增加SAMD3，KRT18基因的表達(dá)，我們推測(cè)這可能是造成成纖維細(xì)胞的過(guò)度聚集和過(guò)度角化病變的潛在原因[13-15]。

本研究結(jié)果對(duì)于揭示雄激素的作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)，以及對(duì)成纖維細(xì)胞基因表達(dá)的影響提供了系統(tǒng)性的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，可能為后續(xù)泌尿系統(tǒng)纖維化尤其是尿道形成疤痕病理機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。在后續(xù)的研究過(guò)程中，我們將進(jìn)一步研究纖維化過(guò)程中各個(gè)相關(guān)基因通路的相關(guān)性及相互作用，對(duì)于該問(wèn)題的深入分析，有望發(fā)現(xiàn)尿道疤痕形成中的關(guān)鍵問(wèn)題，為進(jìn)一步明確尿道狹窄疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制，并為后期疾病的預(yù)防工作新思路、新策略打下基礎(chǔ)。