李婧 劉麗萍 杜黎 崔迎紅 謝梨 田玫 曾媛 李健，2**

1.湖南師范大學醫(yī)學院,模式動物與干細胞生物學湖南省重點實驗室（湖南 長沙 410013）2.湖南師范大學醫(yī)學院小分子靶向藥物發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)制湖南省重點實驗室（湖南 長沙 410013）

1α,25-(OH)2D3（1α,25-dihydroxyvitaminD3）是維生素D活性形式，是調節(jié)人體內鈣磷穩(wěn)態(tài)方面的脂溶性類固醇，能夠促進鈣、磷等物質吸收，可促進骨的形成和骨吸收，對人體的生長、骨骼發(fā)育、機體代謝具有重要影響[1]。而且，研究發(fā)現(xiàn)1α,25-(OH)2D3能抑制腫瘤細胞的增殖，并誘導腫瘤細胞凋亡[2]。

近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)維生素D對男性睪丸組織、精原細胞和精子功能有著重要影響。有動物研究表示小鼠從早期3周開始喂養(yǎng)維生素D含量不足的食物，7周導致睪丸的重量下降、精子質量下降，睪丸精子細胞增殖受抑制、血清和睪丸睪酮下降，睪丸睪酮合成酶下調，生殖能力下降，可見維生素D攝取不足導致睪丸發(fā)育和精子形成受損[3]。精原干細胞(spermatogonial stem cells，SSCs)附于曲細精管的基底膜上[4]，是男性將遺傳物傳遞給子代唯一的成體干細胞，是一切精子發(fā)生的基礎。然而，翻閱各種文獻發(fā)現(xiàn)有關1α,25-(OH)2D3對精原干細胞的作用的研究甚少。1α,25-(OH)2D3是否會對精原干細胞的增殖和凋亡產生影響呢？其具體的作用機制是什么呢？本研究將為維生素D的研究提供新的材料，為男性不育的治療提供新的靶標與干預途徑。

材料和方法

一、主要實驗材料和試劑

1,25-(OH)2D3（美國Sigma公司），DMEM/F12基礎培養(yǎng)液（美國Gbico公司），磷酸鹽緩沖液(PBS)（美國HyClone公司），胰蛋白酶（美國Gibco公司），DMSO（二甲基亞砜）（美國Gbico公司），F(xiàn)BS（胎牛血清）（美國Gbico公司），CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司），Annexin V and Propidium lodide（PI）試劑盒（中國賽默飛世爾有限公司），反轉錄試劑盒（艾科瑞生物公司），qRT-PCR熒光定量試劑盒（艾科瑞生物公司）。C18-4細胞株由模式動物與干細胞生物學湖南省重點實驗室贈予。

二、細胞的培養(yǎng)和傳代

將C18-4細胞復蘇后，放入DMEM/F2培養(yǎng)液（含10%血清）的培養(yǎng)皿中，置于細胞培養(yǎng)箱（37℃,5%CO2）。細胞達到80%后先用PBS沖洗3遍，用適量的胰蛋白酶消化，進行傳代。

三、qRT-PCR對小鼠精原干細胞系C18-4細胞鑒定

用qRT-PCR對C18-4細胞Dazl、Plzf、Oct-4、Thy1、Gfra1基因進行檢測,以Gapdh為內參。實驗步驟：采用胰蛋白酶消化C18-4細胞，采用Trizol法進行RNA提取，逆轉錄cDNA，然后進行PCR擴增。PCR擴增程序：95°C5min，（95°C10min，72°C7min，60°C30s）35個循環(huán)，每個樣本重復3次。Gapdh基因引物序列為F：5’-AAGGGCTCATGACCACAGTC-3’,R:5’-ACACATTG GGGGTAGGAACA-3’;Gfra1基因引物序列為F:5’-ATCCCTTTCCATTTTGCTGGCGTCC-3’,R:5’-CATC CTGGGCTCCTTCCT-3’;Plzf基因引物序列 為F:5’-CTGTGGCAAGAAGTTCAGCCTCAAG-3’,R:5’-CAC TGGTATGGCGAGGC-3’;Oct-4基因引物序列為F：5’-CCTGGCTTCAGACTTCGC-3’,R：5’-GCTTTCCACT CGTGCTCC-3’;Dazl基因引物序列為F:5’-GATGGATGAAACCGAAATCAGG-3’,R:5’-TCTGCACATCCACGTCATTATA-3’;Thy1基 因 引 物 序 列 為F:5’-TCGCTCTCCTGCTCTCAGTCTTG-3’,R:5’-CATCCT TGGTGGTGAAGTTGGCT-3’.

四、免疫熒光法對小鼠精原干細胞系C18-4細胞鑒定

將培養(yǎng)C18-4細胞用胰蛋白酶消化后用DPBS洗兩次，離心去上清，加入4%多聚甲醛溶液，放置于室溫下固定10min，用DPBS洗三次，每次5 min，隨后用適量PBS重懸細胞于甩片機上400g/min,離心2 min，進行細胞甩片。繼續(xù)用含5%BSA室溫下封閉1h，封閉后直接加入一抗4℃共孵育，過夜。吸進后DPBS洗三次，每次5min。繼續(xù)加入二抗在室溫下孵育1h，一定要完全避光。DPBS洗三次，每次5min，加入DAPI室溫共孵育8min，DPBS洗三次，每次5 min。最后加入防熒光猝滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

五、CCK-8法檢測細胞活力

將收集到的C18-4細胞用胰蛋白酶消化細胞并接種于96孔培養(yǎng)板內，每孔接種活細胞數(shù)為1×105個，培養(yǎng)液為加入了10%FBS、DMEM/F2培養(yǎng)液，每個梯度設置3個重復孔，每孔內培養(yǎng)液總體積為100μL，96孔板進行37℃、5%CO2濃度、濕度的條件下孵育24h，PBS清洗3遍，加入1α,25-(OH)2D3處理。實驗分為5個梯度：0（對照組加入同等濃度的DMSO）、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M。設置12h、24h和48h 3個培養(yǎng)時間。37℃、5%CO2濃度、濕度的條件下孵育48h。每隔12h、24h、48h取出 一個96孔板，每孔加入10μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。4h后從培養(yǎng)箱取出，將96孔板放入酶標儀，并調制450nm波長，用于檢測吸光度值。

六、流式細胞儀檢測細胞凋亡率

將C18-4細胞以每孔5×106個細胞接種于六孔板，并設立3個對照孔(Blank、FITC和PI)，24h后加1α,25-(OH)2D3濃度為10-7M，處理48h后收集上清液加入1ml PBS打 散 細 胞，1000r離 心5min，棄上清液，加入300-500μL binding buffer（1X），分別加入5μL Annexin V溶液和1μL100μg/ml PI溶液，避光孵育細胞15min。孵育后添加400μL的1X Annexin結合緩沖液，通過流式細胞儀檢測。

七、qRT-PCR法測定維生素D處理對基因表達的影響

10-7M1α,25-(OH)2D3濃度處理C18-4細胞48h后，用胰蛋白酶消化細胞，用Trizol提取總RNA，通過逆轉錄形成cDNA后 進 行PCR擴 增。95°C5min，（95℃10min，60℃30s）經過40個循環(huán)，最后熔解曲線（95℃15s，60℃60s，95℃15s）。每個樣品設置3個復孔，實驗結果用Gapdh作為內參照，采用2-ΔΔCT進行結果分析。引物序列:Gapdh：F:5’-TGACCTCAACTACATGGTCTACA-3’,R:5’-CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3’;Pcna：F：5’-TTTGAGGCACGCCTGATCC-3’,R:5’-GG AGACGTGAGACGAGTCCAT-3’;Bax：F:5’-CCGGCGAATTGGAGATGAACT-3’,R:5’-CCAGCCCATGAT GGTTCTGAT-3’;Bcl-2：F:5’-GCTACCGTCGTGACTT CGC-3’,R:5’-CCCCACCGAACTCAAAGAAGG-3’;Vdr：F:5’-GTGCAGCGTAAGCGAGAGAT-3’,R:5’-GGATG GCGATAATGTGCTGTTG-3’。

八、統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，兩組之間的比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組之間相比較采用單因素方差分析，若方差齊，采用LSD法，如若方差不齊，則采用Dunnett’s T3法檢驗。P＜0.05則表示有差異，具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、細胞鑒定

RT-PCR結果 顯示Dazl、Plzf、Oct-4、Thy1、GFRA1基因均有表達（圖1A），免疫熒光染色顯示C18-4細胞表達GFRA1和PLZF蛋白（圖1B和C），通過兩種方法鑒定細胞為小鼠精原干細胞，可用于后續(xù)的實驗。

二、CCK-8法檢測1α,25-(OH)2D3對C18-4細胞細胞活力的影響

采用CCK-8法檢測不同濃度和作用時間的1α,25-(OH)2D3對C18-4細胞細胞活力和增殖的影響，結果顯示：與對照組比較，10-7M、10-9M和10-10M濃度的1α,25-(OH)2D3處理24h后C18-4細胞活力顯著降低（P＜0.05)；10-7M的1α,25-(OH)2D3處理48h后C18-4細 胞活力顯著降低（P＜0.05)。因此，后續(xù)實驗我們選擇1α,25-(OH)2D3作用濃度為10-7M（圖2）。

圖1 小鼠精原干細胞的鑒定圖A：RT-PCR凝膠電泳結果圖；B和C：GFRA1和PLZF蛋白在細胞中的表達結果圖(×200倍)

圖2 1α,25(OH)2D3處理C18-4后細胞活力的CCK-8檢測結果

三、1α,25-(OH)2D3對C18-4細胞凋亡的影響

采用流式細胞儀（AnnexinV/PI染色）檢測10-7M濃度的1α,25-(OH)2D3處理對C18-4細胞48h后細胞凋亡的影響，結果顯示：與對照組相比，10-7M濃度1α,25-(OH)2D3處理小鼠精原干細胞導致C18-4細胞總凋亡率和晚期凋亡率趨勢增加，而早期凋亡率顯著增加（P＜0.05)（圖3）。

四、1α,25-(OH)2D3對C18-4細胞增殖和凋亡的相關基因的影響

采用qRT-PCR方法檢測1α,25-(OH)2D3對C18-4細胞增殖和凋亡相關基因表達的影響，結果顯示：與對照組相比，10-7M濃度1α,25-(OH)2D3處理小鼠精原干細胞導致C18-4細胞Bax基因（1.00±0.02 vs 1.16±0.06，P＜0.05）、Vdr基因（1.00±0.04 vs 1.33±0.01,P＜0.05）表達明顯上升，Bcl-2基因（1.00±0.05 vs 0.57±0.06，P＜0.05）和Pcna基因（1.00±0.03 vs 0.82±0.01，P＜0.05）表達明顯下降（圖4）。

圖3 1α,25(OH)2D3對小鼠精原干細胞凋亡的影響

圖4 1α,25-(OH)2D3對C18-4細胞Bcl-2、Bax、VdrA和Pcna mRNA表達的影響

討 論

研究報道1α,25-(OH)2D3除了對鈣磷代謝有調節(jié)作用以外，還具有抑制細胞增殖、促進凋亡等作用，這其中包括對多種腫瘤細胞具有調節(jié)作用，可以抑制乳腺癌、卵巢癌、結腸癌等腫瘤的生長[5]。經食物與陽光紫外線攝取一定數(shù)量的維生素D可以預防腫瘤[6]，這可以歸納為1α,25-(OH)2D3能抑制腫瘤細胞的增殖。有研究表明：1α,25-(OH)2D3通過維生素D受體（VDR）非依賴性的方式激活了蛋白激酶C、促分裂原活化的蛋白激酶A和磷脂酰肌醇3-激酶等，從而引起體內的鈣離子變化，及體內各種蛋白失去活化的狀態(tài)，最終影響細胞的增殖與凋亡[7,8]。

精原干細胞具有自我更新能力，能夠將基因傳遞至子代，因此精原干細胞是精子發(fā)生的至關重要的載體[9]。本研究CCK-8法實驗結果顯示：與對照組相比，10-7M濃度1α,25-(OH)2D3處理小鼠精原干細胞后24h和48h細胞活力均降低。此研究結果與Ooi B等的研究[10]一致，他們的研究發(fā)現(xiàn)1α,25(OH)2D3對小鼠的系膜細胞增殖具有調節(jié)作用。1α,25-(OH)2D3與靶細胞上的VDR結合后,調控靶細胞的相關功能。本研究qRT-PCR顯示10-7M濃度1α,25-(OH)2D3處理C18-4細胞后Vdr基因表達顯著上調。此研究與Srikuea R等[11]研究結果一致。其研究表明C2C12骨骼肌細胞經1α,25-(OH)2D3(20 nM)或25(OH)D3(2 M)處理后，Vdr基因表達顯著上調。Pcna基因與細胞增殖有關，G0/G1期是決定著細胞增殖的速度，G1期的增加與細胞的凋亡有關，因為G1期阻滯可能導致抗增殖[8]。Pcna基因與這種細胞增殖與凋亡周期有關，在DNA合成的G1期開始增加，S期到達頂峰，至G2/M期又降下來[12]。Pcna基因的表達可能是因為細胞內游離的Ca2+增加，從而能抑制細胞增殖。本研究結果顯示10-7M濃度1α,25-(OH)2D3處理小鼠精原干細胞后Pcna基因表達下降。說明維生素D可能通過抑制Pcna基因的表達，而抑制精原干細胞的增殖，進而導致精原干細胞Vdr基因表達增加。

凋亡是細胞命運的重要方面。本研究流式細胞儀（AnnexinV/PI染色）實驗結果顯示：與對照組相比，10-7M濃度1α,25-(OH)2D3處理小鼠精原干細胞導致總凋亡率和晚期凋亡率趨勢增加，而早期凋亡率顯著增加，說明小鼠精原干細胞較高濃度的維生素D作用細胞凋亡增加。Bax基因屬于Bcl-2基因家族的一員，大多數(shù)Bax蛋白質位于細胞漿中以單體形式存在，如果細胞接受凋亡信號，則Bax基因可以提高線粒體滲透性，改變線粒體，并轉化孔開放，隨之釋放細胞色素C,最后激活下游半胱天冬酶Caspase的級聯(lián)反應,細胞凋亡產生[13]。Bcl-2基因是Bcl-2家族里最重要的抗凋亡因子[15-17]。Bcl-2通過減少凋亡誘導因子與同家族基因Bax結合阻抑凋亡蛋白酶等，產生抗凋亡作用[18]。Bcl-2基因作為廣義的凋亡基因有著許多外號，例如長壽基因，在各界備受關注。它可以經過抑制細胞內Ca2+超載,減低脂質過氧化物對中樞神經系統(tǒng)的毒性作用,調節(jié)細胞凋亡[19,20]。當Bax基因表達時，Bax的相對量大于Bcl-2，并且Bax/Bax同源二聚體的量大于Bcl-2/Bax異源二聚體的量，其表示促進細胞凋亡;反之，當Bax的相對量少于Bcl-2,并且異源二聚體Bcl-2/Bax的量高于同源二聚體Bax/Bax,則表示為抑制細胞凋亡[14]。本研究結果顯示10-7M濃度1α,25-(OH)2D3處理小鼠精原干細胞后Bax基因表達顯著上調，而Bcl-2基因表達顯著下調。說明維生素D通過影響B(tài)ax/Bcl-2途徑，導致精原干細胞凋亡增加。

因此，本研究發(fā)現(xiàn)較高濃度的1α,25-(OH)2D3會抑制精原干細胞的增殖和促進精原干細胞的凋亡，這些與維生素D影響精原干細胞Bax、Bcl-2，Pcna基因和Vdr基因mRNA表達有關。本研究為維生素D對精原干細胞增殖與凋亡調控的作用及其相關機制提供了新材料。但是，精原干細胞體外培養(yǎng)離開了睪丸組織微環(huán)境，高濃度的維生素D攝取是否會通過抑制精原干細胞的生長,從而抑制精子發(fā)生，這有待動物實驗和臨床研究來確證，以進一步明確維生素D在男性生殖功能中的作用。