孫曉璐，楊永學(xué)，郭 斌，張 源，蘭 偉

（1.阜陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生化工程系 安徽阜陽(yáng) 236037 2.阜陽(yáng)師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院 安徽阜陽(yáng) 236037)

葡萄作為目前世界上栽植面積最廣、產(chǎn)量最高的水果之一，其副產(chǎn)物葡萄酒也頗受大眾歡迎[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)2012 年的葡萄種植面積為57萬(wàn)hm2，占全球葡萄種植總面積的7.6%[2,3]。多個(gè)研究表明，葡萄酒中風(fēng)味物質(zhì)主要由葡萄品種、工藝條件產(chǎn)、釀酒微生物幾大因素決定[4,5]。確定葡萄品種后，要釀造出風(fēng)味獨(dú)特的葡萄酒，釀酒的酵母菌種品種選擇在助力發(fā)酵中作用就很突出。釀酒酵母具有將果實(shí)中的糖代謝得到醇、醛、酯等功能性物質(zhì)，賦予葡萄酒獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)[6]。相比釀酒酵母，非釀酒酵母可產(chǎn)生多種酯類[7]、多種酶類（如果膠酶、糖苷酶等）和較多的甘油，進(jìn)而揮發(fā)出獨(dú)特的香氣[8,9]。

研究表明，葡萄產(chǎn)區(qū)所釀造出的葡萄酒常具有其地域特色和獨(dú)特風(fēng)格[10,11]。薛波等[12]通過(guò)對(duì)從新疆采集的7 株野生型釀酒酵母分析其酒精、低pH 值、SO2、高濃度葡萄糖耐受性研究發(fā)現(xiàn)：該7株野生型新疆釀酒酵母基本都能耐受12%的酒精；當(dāng)pH=2.5 時(shí)，菌株也可以正常生長(zhǎng)；當(dāng)SO2的濃度=250 mg/L 時(shí)，野生釀酒酵母也能夠繼續(xù)生長(zhǎng)；所有菌株都能夠耐受低于50%葡萄糖的濃度；即這7 株具有優(yōu)良的耐受性和釀酒特性[13]。李藝凡等[14]從紅茶菌液中分離出了酵母H8，并且將其與全美梅氏酵母、葡萄有孢漢生酵母按等比例混合培養(yǎng)46 h 后獲得了混菌酵母。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)該類酵母發(fā)酵后含有較多單菌種沒(méi)有的物質(zhì)，使得其香氣具有獨(dú)特性[15-18]。鄭曉吉等人[19]從新疆第六師葡萄產(chǎn)區(qū)的土壤和葡萄皮中分離出127 株酵母菌，并通過(guò)分析其綜合性耐受性實(shí)驗(yàn)獲得F12，該菌株能在10～35 ℃、含糖＞400 g/L、SO2含量＞200 mg/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)＞15%、含酸量＞18 g/L 的葡萄汁中發(fā)酵。

目前，大部分研究?jī)?nèi)容限于在天然或馴化后的釀酒酵母的發(fā)酵條件的優(yōu)化，而對(duì)非釀酒酵母的研究不多。本研究通過(guò)分離安徽阜陽(yáng)葡天下所產(chǎn)的葡萄皮中的菌株，并對(duì)所分離的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定，以獲得更適合本地區(qū)氣候的菌株。通過(guò)形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定確定葡萄酒發(fā)酵體系中非釀酒酵母對(duì)香氣物質(zhì)富集與酒品整體風(fēng)味具有一定影響力，并由此在葡萄酒釀造中引入多菌種發(fā)酵新工藝，顯示出非釀酒酵母在葡萄酒釀造中的獨(dú)特作用，豐富了自然發(fā)酵體系中非釀酒酵母品種，進(jìn)一步挖掘非釀酒酵母的價(jià)值具有一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：葡萄采摘于安徽阜陽(yáng)葡天下。試劑：SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒SK8191、DNA Ladder Mix maker SM0337、DreamTaq-TM DNA Polymerase EP0702：生工生物工程（上海）股份有限公司；pMD?18-T Vector 連接試劑盒D101A：日本Takara（寶生物）工程有限公司；氯化鈉、葡萄糖、EDTA、CTAB、SDS 等其他生化試劑均為市售分析純。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：豆芽汁培養(yǎng)基。YPD 培養(yǎng)基：1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種富集

將少量葡萄皮加入到100 mL 滅菌的豆芽汁培養(yǎng)基中，并置于25 ℃、100 rpm/min 搖瓶中培養(yǎng)48 h。吸取1 mL 生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋分別為（10-2、10-3、10-4），再吸取稀釋液100 μL 涂布在WL培養(yǎng)基中，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)3 次，置于30 ℃環(huán)境中培養(yǎng)48 h[20-,21]。

待豆芽汁培養(yǎng)液發(fā)酵后，吸取200 μL 培養(yǎng)液涂布于WL 培養(yǎng)基中（加青霉素至終濃度100 μg/mL），置于25 ℃環(huán)境中培養(yǎng)48～72 h[22]。

1.3.2 分離純化

將顏色不同的菌落接入YPD 平板，多次劃線分離培養(yǎng)，進(jìn)行分離純化。

挑取生長(zhǎng)良好的單菌落（共計(jì)8 個(gè)菌落），轉(zhuǎn)入YPD 液體培養(yǎng)基中，12 層紗布封口，置于30 ℃環(huán)境并以180 rpm/min 振蕩培養(yǎng)，并測(cè)定24 h、48 h、72 h 和96 h 的生長(zhǎng)速度，以O(shè)D600進(jìn)行計(jì)算[23]。

1.3.3 菌株形態(tài)觀察

通過(guò)制作臨時(shí)裝片，于40×的油鏡下觀察，記錄細(xì)胞形態(tài)特征、細(xì)胞大小、出芽情況。置于熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行采集，得到相關(guān)酵母細(xì)胞形態(tài)圖像，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.4 菌株DNA 提取和PCR 反應(yīng)

按照SK8255（細(xì)菌）、SK8259（真菌）、SK8257（酵母）試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行菌株DNA 提取。使用通用引物F（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’）和R（5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’）擴(kuò)增。

PCR 循環(huán)條件：先置于94 ℃環(huán)境中預(yù)變性4 min，接著置于94 ℃中45 s 使模板變性，55 ℃中45 s 使引物與模板退火，72 ℃中1 min 使引物在模板上延伸，改反應(yīng)程度循環(huán)30 次，然后置于72 ℃中修復(fù)延伸10 min，最后PCR 產(chǎn)物置于4 ℃中終止反應(yīng)并保存[24,25]。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳20 min，條件為150 V、100 mA。

1.3.5 基因片段的測(cè)序與分析

用DNA 膠回收試劑盒（Omega）進(jìn)行切膠回收得到電泳條帶，進(jìn)行純化和測(cè)序。

1.3.6 構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

將上述獲得的測(cè)序結(jié)果錄入GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用其提供的Blast 功能進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)測(cè)序結(jié)果的同源性比對(duì)分析。通過(guò)Mega 7.0 軟件[26]進(jìn)行構(gòu)建菌株P(guān)1 和菌株P(guān)2 系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄皮中酵母菌的篩選

利用平板涂布法從自然發(fā)酵的葡萄皮中選取樣品，進(jìn)而分離得到單菌落菌株。經(jīng)培養(yǎng)后平板內(nèi)逐漸開始出現(xiàn)長(zhǎng)勢(shì)不同的酵母菌。分別在測(cè)定其在24 h、48 h、72 h 和96 h 的生長(zhǎng)速度如表1 中所示：當(dāng)培養(yǎng)24 h 時(shí)，P2 ＞P1＞P3 ＞P5 ＞P4、P6 ＞P7、P8；當(dāng)培養(yǎng)48 h 時(shí)，P2 ＞P1 ＞P3 ＞P5 ＞P6 ＞P4 ＞P8 ＞P7；當(dāng)培養(yǎng)72 h 時(shí)，P2 ＞P1 ＞P3 ＞P4 ＞P5 ＞P6 ＞P7 ＞P8；當(dāng)培養(yǎng)96 h時(shí)，P3 ＞P1、P5 ＞P2 ＞P4、P6 ＞P7 ＞P8。相比其他菌株，P1（3.2、6.5、6.8、4.1）、P2（3.4、6.6、7.0、3.9）和P3（2.3、6.3、6.6、4.5）這三個(gè)菌株的24 h、48 h、72 h 和96 h 的OD600較高有較好的生長(zhǎng)活性。

對(duì)該8 株菌株的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果如表2。8 株菌株均可耐受葡萄糖和麥芽糖，但是對(duì)于乳糖和蔗糖的耐受結(jié)果不同：P2、P4 和P7 可耐受乳糖，但不可耐受蔗糖；P1、P3 和P8 可耐受蔗糖，但不可耐受乳糖；P5 對(duì)于乳糖和蔗糖均可耐受；P6 對(duì)于乳糖和蔗糖均不可耐受。由于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中為了比較其中的差別，故而選取乳糖陽(yáng)性而蔗糖陰性和蔗糖陽(yáng)性而乳糖陰性，且生長(zhǎng)速度良好的兩株菌株，即P1 和P2。后續(xù)形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定實(shí)驗(yàn)均以P1 和P2 作為研究對(duì)象。

2.2 分離菌株形態(tài)特征及分子生物學(xué)鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征

經(jīng)過(guò)篩選得到的P1 和P2 這兩株菌株在平板上的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)如圖1 所示。A1 和A2圖所示菌落黃色略帶粉色，表面光滑扁平，邊緣整齊。通過(guò)置于熒光倒置顯微鏡下（10*40）進(jìn)行采集觀察，B1 和B2 圖所示細(xì)胞多呈卵圓形，且具有典型的真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

圖1 菌株的菌落及細(xì)胞形態(tài)

2.2.2 基因的分子生物學(xué)鑒定

提取P1 和P2 菌株中的DNA，并使用引物來(lái)擴(kuò)增其ITS rDNA，對(duì)其PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

由圖2 可知，P1 和P2 兩株菌株電泳條帶不同，但都在ITS rDNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物條帶范圍內(nèi)：P1 擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小約在1500 bp 左右，P2擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小約在600 bp 左右，且兩株菌株的擴(kuò)增條帶清晰明亮可見(jiàn)，無(wú)明顯非特異性擴(kuò)增。因此該P(yáng)CR 產(chǎn)物可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2.2.3 分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

借助NCBI 中的Blast 功能將本實(shí)驗(yàn)中的2株菌株的ITS rDNA 與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)菌株的同源性比對(duì)進(jìn)行分析。構(gòu)建P1 和P2 這兩個(gè)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果如圖3 所示。P1 和近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）JN544046.1 為一個(gè)分支，P2 和金黃蝶形擔(dān)孢酵母（Papiliotrema flavescens）MK026970.1 為一個(gè)分支。之后使用Bootstrap 檢驗(yàn)1000 次隨機(jī)重復(fù)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證上述結(jié)果。綜合P1 和P2 菌株的菌落及細(xì)胞形態(tài)觀察、PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)P1 和P2 這兩株菌株按照親緣關(guān)系可分屬于2 個(gè)種：Sporidiobolus pararoseus JN544046.1：P1；Papiliotrema flavescens MK026970.1：P2。

圖3 系統(tǒng)發(fā)育樹（P1 和P2）

3 結(jié)論與討論

本研究利用平板涂布法從自然發(fā)酵的葡萄皮中分離得到8 株酵母菌株。其中兩個(gè)菌株（P1、P2）分別對(duì)蔗糖和乳糖具有良好的耐受性，且生長(zhǎng)速度良好。通過(guò)形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定確定了這兩株菌株可分屬于2 個(gè)種：近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）；金黃蝶形擔(dān)孢酵母（Papiliotrema flavescens）。近年來(lái)，對(duì)葡萄酒發(fā)酵體系中非釀酒酵母的探究已充分證明其對(duì)香氣物質(zhì)富集與酒品整體風(fēng)味呈現(xiàn)的影響力[27]，并由此在葡萄酒釀造中引入了多菌種發(fā)酵（非釀酒酵母與釀酒酵母混菌或順序發(fā)酵）新工藝，顯示出非釀酒酵母在葡萄酒（果酒）釀造中的獨(dú)特價(jià)值[28]。

在酒精代謝活動(dòng)開始前，葡萄汁中非釀酒酵母都能夠快速增殖并且在控制條件下的生長(zhǎng)代謝，有助于改善葡萄酒的結(jié)構(gòu)與風(fēng)味復(fù)雜性[29]，這種發(fā)酵方式在一定程度上通過(guò)了不同種類發(fā)酵菌種間的協(xié)同作用，從而表現(xiàn)出不同的發(fā)酵效果，體現(xiàn)了非釀酒酵母在發(fā)酵葡萄酒中的潛在應(yīng)用價(jià)值，也為呈香物質(zhì)的優(yōu)化提供了有力借鑒[30]。目前，相關(guān)研究較多集中于使用釀酒酵母，發(fā)酵葡萄酒中的非釀酒酵母菌群的可控制混合發(fā)酵效果探討領(lǐng)域，本研究對(duì)豐富自然發(fā)酵體系中非釀酒酵母的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步挖掘非釀酒酵母的價(jià)值具有一定意義。