徐雯潔，張 涵，張 濤，劉曉麗，耿雪俠，張海軍

（淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000）

乳腺癌是發(fā)生于乳腺腺上皮組織的一種惡性腫瘤疾病，近年來在女性中發(fā)病率極高，居各類疾病首位。乳腺癌引起的死亡率也越來越高，居第四位，對全球女性的生命健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1]。雖然早期可通過手術(shù)進(jìn)行治療，但由于檢測和診斷手段的不足，及對該病發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究還不夠深入，往往發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)發(fā)生了癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，這是乳腺癌發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升的重要原因，因此明晰乳腺癌發(fā)病和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，將有利于針對該病檢測和診斷，以及治療方法的研發(fā)[2]。

TNRC9 基因又稱TOX3，位于染色體16q1.2，含3 個核苷酸重復(fù)基序和一個假定基因LOC643714，該基因可能與與乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)[3]；另外，TOX3 蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)量較高[4]。與正常組織相比，乳腺癌組織中TOX3基因亞族發(fā)生甲基化的比例明顯升高，而甲基化后的轉(zhuǎn)錄水平在很大程度上會降低，啟動子區(qū)CpG 島有該基因的甲基化區(qū)域[5]，推測TOX 基因的作用可能類似于抑癌基因，腫瘤的發(fā)生可能是由該基因的啟動子發(fā)生了超甲基化導(dǎo)致了相關(guān)基因的沉默，但具體致癌機(jī)制尚未明確[6-7]。PPP2R1A 是PPP2A 結(jié)構(gòu)亞基A，α 亞型，作為蛋白磷酸酶PP2A 的結(jié)構(gòu)亞基，是細(xì)胞生長和增殖至關(guān)重要的正性調(diào)節(jié)蛋白，在PP2A 全酶催化過程中起著支架和聯(lián)結(jié)的作用[8-10]，Calin GA 等[11]檢測到PPP2R1A 在肺癌、乳腺癌及惡性黑素瘤中出現(xiàn)不同的突變體，對腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移有抑制作用。PTEN 基因定位于人類染色體10q23.3，是一種具有磷酸酯酶活性的腫瘤抑制基因，能與多種信號通路相互作用，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期等[12]，已有研究發(fā)現(xiàn)PTEN 基因中存在突變或甲基化等遺傳學(xué)改變。PTEN 基因的第5、8 外顯子因其較高的突變率已成為眾多相關(guān)實(shí)驗(yàn)中成為研究的熱點(diǎn)區(qū)位[13-14]。有研究表明PTEN 基因外顯子5、7、8 在前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌及晚期神經(jīng)膠質(zhì)瘤中突變率高達(dá)40%[15]。

HRM 系統(tǒng)是近年來用于檢測DNA 片段單個堿基是否發(fā)生突變的一種新技術(shù)，具有檢測時間短、特異性高、高通量、單管無污染、靈敏度高等特點(diǎn)，該方法可檢測出單個堿基的差異[16-17]。選用HRM 系統(tǒng)分析基因突變位點(diǎn)，主要是通過DNA片段長短、堿基含量、堿基分布的差異，利用熔解曲線形狀和高度位置的細(xì)微差距，檢測基因是否發(fā)生突變[18]。

本實(shí)驗(yàn)通過HRM 法檢測乳腺癌組織中PTEN 的5 號外顯子、TOX3 的7 號外顯子、PPP2R1A 的6 號外顯子的基因突變情況，進(jìn)一步結(jié)合基因測序技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，找出這3 個基因中可能與乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的位點(diǎn)，為進(jìn)一步快速篩選乳腺癌提供了有效且快速的方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從青海某醫(yī)院獲得的具有完整病例且經(jīng)過病理學(xué)確診的36 例乳腺癌冷凍組織標(biāo)本和1 例癌旁組織。

1.2 檢測方法

1.2.1 基因組DNA 提取

通過Ezup 柱式動物基因組DNA 抽提試劑盒（上海生工生物公司）對乳腺癌樣本組織進(jìn)行基因組DNA 提取，通過超微量分光光度計測定DNA濃度及純度。

1.2.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中上傳的TOX3、PPP2R1、PTEN 等基因的SNP 序列，通過使用引物設(shè)計軟件Primer Premier 設(shè)計特異性引物，由上海生工生物公司合成，序列如下表1。

表1 HRM 分析引物序列

通過常規(guī)PCR 擴(kuò)增體系與瓊脂糖凝膠電泳觀察電泳條帶分析結(jié)果，檢測引物擴(kuò)增效率及特異性。體系如下（10 μL）：DNA 模板（0.5 μL）、ddH2O（3.7 μL）、Forward 引物（0.4 μL）、Reverse 引物（0.4 μL）、2×Taq PCR Master Mix（5 μL）。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94 ℃，2 min；變性94 ℃，30 s，退火55 ℃，30 s，延伸72 ℃，30 s；40 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 HRM 檢測

按照下列比例配制HRM 擴(kuò)增的PCR 反應(yīng)體系（10 μL）為：RNase-Free ddH2O（6.5 μL）、2×HRM Analysis Premix（5 μL）、10 μM Forward 引物（0.3 μL）、10 μM Reverse 引物（0.3 μL）、DNA 模板（0.5 μL）。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40 個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后用Lightscanner 進(jìn)行HRM 檢測與分析。

1.4 測序驗(yàn)證

為了進(jìn)一步說明基因的突變情況，根據(jù)HRM分析結(jié)果，選擇不同突變類型的樣品和癌旁組織樣品通過PCR 擴(kuò)增后，送擴(kuò)增產(chǎn)物到上海生工生物公司進(jìn)行測序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組濃度和純度測定

對乳腺癌組織和癌旁組織樣本進(jìn)行基因組提取，通過檢測所有樣本的DNA 濃度A260/A280均在1.8-2.0 之間，滿足HRM 分析要求。

2.2 引物擴(kuò)增特異性檢測

針對TOX3 基因7 號外顯子、PPP2R1A 基因6 號外顯子、PTEN 基因5 號外顯子設(shè)計的特異性引物合成后通過常規(guī)PCR 進(jìn)行抽樣檢測，結(jié)果見圖1，各引物擴(kuò)增效果和特異性均較高，可用于HRM 分析。

圖1 各引物擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增結(jié)果檢測電泳圖。

2.3 高分辨率熔解曲線分析法結(jié)果及測序結(jié)果

通過高分辨率熔解曲線對待測的36 例乳腺癌組織和1 例癌旁組織樣品進(jìn)行分析，根據(jù)分析結(jié)果分別選擇突變樣本和癌旁組織進(jìn)行測序。

TOX3 基因7 號外顯子與PPP2RA1 基因6號外顯子的高分辨率熔解曲線圖均未發(fā)生突變（圖2，圖3）；測序結(jié)果顯示TOX3 基因7 號外顯子第1102 位核苷酸基因型為CC（圖2c），與HRM結(jié)果一致；PPP2R1A 基因6 號號外顯子1025 位核苷酸基因型均為CC（圖3c）未發(fā)生基因突變，結(jié)果一致。說明TOX3 基因7 號外顯子與PPP2R1A 基因5 號外顯子不是乳腺癌的熱點(diǎn)突變位置，可能與乳腺癌的發(fā)生無關(guān)或相關(guān)性較差。

圖2 基因TOX3 外顯子的高分辨率熔解曲線。

PTEN 基因5 號外顯子的熔解曲線與差分曲線分析結(jié)果顯示該基因在5 號外顯子存在一種類型的突變體，如圖4a、4b 所示；通過對突變樣品和癌旁組織擴(kuò)增后進(jìn)行測序分析，結(jié)果顯示PTEN 基因5 號外顯子第1408 位核苷酸基因由A 突變?yōu)門（圖4c），導(dǎo)致編碼氨基酸由N 突變?yōu)閅。說明該基因的5 號外顯子可能是PTEN 基因的熱點(diǎn)突變區(qū)，乳腺癌的發(fā)生可能與其突變有一定的關(guān)系。

圖4 基因PTEN 外顯子的高分辨率熔解曲線

3 結(jié)論與討論

乳腺癌在近幾年發(fā)病率和致死率呈持續(xù)升高的走勢[19]，在早期由于缺乏典型臨床癥狀，乳腺癌容易被患者忽視，因此確診時往往至中晚期，使得乳腺癌的致死率仍呈現(xiàn)不斷上升趨勢[20]。通常情況下，乳腺癌的發(fā)病是由環(huán)境要素和基因要素一起導(dǎo)致的。目前雖有對乳腺癌的檢測方法，但乳腺癌的發(fā)病率仍在上升，探究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制受到越來越多的關(guān)注。

雖然已有報道顯示TOX3 基因?qū)儆诟哌w移率染色質(zhì)非組蛋白家族，全基因組關(guān)聯(lián)性研究（Genome-wild association study，GWAS）顯示該為乳腺癌的易感基因中存在TOX3 基因[21]，但本研究通過HRM 分析結(jié)合DNA 測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TOX3基因的7 號外顯子無突變，其原因可能是實(shí)驗(yàn)所用乳腺癌樣本量過少，不能完全篩出突變體，也可能說明該基因與乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的相關(guān)性不高，進(jìn)一步確認(rèn)仍需大量樣本進(jìn)行進(jìn)一步檢測；PPP2R1A 基因被發(fā)現(xiàn)在上皮性卵巢中高頻突變，且有研究檢測在肺癌、結(jié)腸癌、子宮漿液性腫瘤等惡性腫瘤中基因突變，其可能與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)[22]。但本研究通過HRM 分析和測序針對突變熱點(diǎn)PPP2R1A 基因6 號外顯子進(jìn)行檢測，結(jié)果均未檢測到突變體，推測該基因的6 號外顯子與乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)性較低或不相關(guān)，或因樣本數(shù)量太少未檢測出突變體。

PTEN 基因是1997 年在染色體10q 發(fā)現(xiàn)的具有雙特異性的一個抑癌基因，其在乳腺癌中的突變率較高，但在侵襲性高的乳腺癌細(xì)胞系中低表達(dá)。本研究通過對PTEN 基因5 號外顯子的HRM 分析和DNA 測序分析發(fā)現(xiàn)，有11 例發(fā)生雜合突變，編碼序列的1408 位點(diǎn)核苷酸由A 突變成T，導(dǎo)致其編碼氨基酸由N 突變?yōu)閅。推測PTEN基因核苷酸序列的突變，或者核苷酸突變所引起的相應(yīng)氨基酸的改變，可能與乳腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)。有研究報道PTEN 基因的錯義突變常發(fā)生在外顯子5 和6 上[23]，多為錯義突變，常發(fā)生于原發(fā)性乳腺癌中。PTEN 基因堿基突變可能位于5 號外顯子的磷酸酯合成酶的核心序列處，導(dǎo)致雙磷酸酶失活不能使體內(nèi)的酪氨酸殘基去磷酸化從而導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖與腫瘤惡性轉(zhuǎn)移；也有可能是PTEN 基因突變使得其編碼的氨基酸改變，蛋白表達(dá)降低影響PI3K/ PTEN/PKB/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑功能進(jìn)而影響乳腺癌細(xì)胞的生長。在乳腺癌中PTEN 的點(diǎn)突變不如雜合性缺失概率高，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步完善這方面的研究，以及檢測到突變位點(diǎn)如何控制調(diào)控乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展。本研究所獲的結(jié)果有助于進(jìn)一步了解乳腺癌的發(fā)生機(jī)制，也為乳腺癌的生理早期預(yù)測所獲得與定點(diǎn)治療提供理論依據(jù)。

4 小結(jié)

基于HRM 分析系統(tǒng)，結(jié)合DNA 測序技術(shù)對36 例乳腺癌組織進(jìn)行檢測，在TOX3 基因的7 號外顯子和PPP2R1A 基因的6 號外顯子未檢測到突變體，但在PTEN 基因的5 號外顯子檢測到該基因第1408 位核苷酸序列由A 突變?yōu)門，可引起其編碼氨基酸由N 突變?yōu)閅。