張世佳，馮建軍，郭松林，王藝?yán)?，?鵬

（集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建 廈門 361021）

滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）［1］是模擬病毒遺傳物質(zhì)滾環(huán)式復(fù)制而建立的一種擴(kuò)增技術(shù)。1994 年，Nilsson 等［2］合成鎖式探針（Padlock probe）并應(yīng)用到RCA 技術(shù)后，使RCA 技術(shù)得到了極大發(fā)展，開始應(yīng)用于醫(yī)學(xué)［3］、食品科學(xué)［4］等領(lǐng)域。相較于常見的分子檢測手段，由于是恒溫擴(kuò)增，無需昂貴的儀器，恒溫水浴鍋便可進(jìn)行，避免了復(fù)雜的反復(fù)升降溫過程，為現(xiàn)場和在線檢測提供了可能。此外，基于鎖式探針的滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)具有極高的特異性，檢測序列與結(jié)合引物引發(fā)擴(kuò)增的中間序列互不影響，可采用一種引物對多種鎖式探針擴(kuò)增，實現(xiàn)多靶標(biāo)檢測［5］，且由于RCA 擴(kuò)增效率高，有效放大了檢測信號，極大地提高了檢測靈敏度［6］。RCA技術(shù)在生物傳感領(lǐng)域的研究進(jìn)展已有報道［7－8］，本文首次綜述了RCA技術(shù)在病原菌、病毒以及其它病原微生物檢測中的應(yīng)用，并對RCA技術(shù)在該領(lǐng)域的前景進(jìn)行了展望。

1 RCA技術(shù)原理與分類

通過模擬病毒或質(zhì)粒的復(fù)制過程，環(huán)狀DNA 在具有鏈置換活性的聚合酶和引物作用下得以實現(xiàn)擴(kuò)增［9］，RCA技術(shù)即在此基礎(chǔ)上發(fā)展而來。RCA反應(yīng)通常需以下條件［10］：①環(huán)狀DNA或RNA模板；②與環(huán)狀模板部分互補(bǔ)的DNA引物；③具有鏈置換性的聚合酶。根據(jù)擴(kuò)增引物數(shù)量可將RCA技術(shù)分為單引物擴(kuò)增RCA（Single-primer RCA）［11］、多引物擴(kuò)增RCA（Multiple-primer RCA）［12］和指數(shù)擴(kuò)增RCA（Exponential RCA）［13］（圖1）。單引物RCA 是指在具有鏈置換性聚合酶的作用下由單一引物引發(fā)環(huán)狀模板延伸，產(chǎn)生長單鏈重復(fù)序列的DNA 分子，可生成幾千倍模板序列的拷貝，連接和擴(kuò)增均在等溫條件下進(jìn)行，無需復(fù)雜的變溫儀器，但單引物引發(fā)的滾環(huán)擴(kuò)增效率相對較慢，且對低豐度序列檢測能力不足。多引物RCA 則在單引物RCA 基礎(chǔ)上，增加了1條或多條與模板互補(bǔ)的引物引發(fā)擴(kuò)增，其擴(kuò)增效率可達(dá)到單引物RCA的數(shù)倍，但相應(yīng)的背景信號也有所上升，易造成結(jié)果假陽性。指數(shù)RCA是在單引物RCA 的基礎(chǔ)上額外加入一條與模板鏈序列一致的短單鏈作為引物，這條引物結(jié)合到RCA 擴(kuò)增出來的線性DNA 產(chǎn)物上，開始擴(kuò)增反應(yīng)，新合成的產(chǎn)物又可作為第一條引物的模板進(jìn)行擴(kuò)增，如此反復(fù)，成指數(shù)級增長，但與多引物RCA一樣，易造成假陽性結(jié)果。

圖1 RCA的分類Fig.1 Classification of RCA

而目前較為流行的基于鎖式探針的RCA［14］其優(yōu)點及創(chuàng)新表現(xiàn)在探針的設(shè)計：該探針設(shè)計了兩端具有與目標(biāo)靶序列完全互補(bǔ)配對的兩個檢測端T1和T2、與引物結(jié)合的擴(kuò)增序列P1和P2以及用于雜交的識別序列zip（圖2）。在反應(yīng)過程中，探針的T1和T2端和目標(biāo)靶序列毗鄰互補(bǔ)，在連接酶作用下連接成環(huán)，有一個堿基不能匹配就無法成環(huán)，保證了檢測的特異性。基于鎖式探針的RCA 實質(zhì)是對環(huán)化探針進(jìn)行擴(kuò)增，并非對靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，最大限度地減少了交叉污染以及實際樣品中抑制因子的影響，放大了信號值，有助于檢測靈敏度的提高。

圖2 鎖式探針Fig.2 Padlock probe

2 RCA在病原檢測中的應(yīng)用

病原微生物是指侵入生物體引起感染甚至傳染病的微生物，常見的病原微生物包括細(xì)菌、病毒、真菌、衣原體、支原體等，病原微生物不僅會造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅人體健康［15］。傳統(tǒng)的微生物檢測（如染色鏡檢和分離培養(yǎng)）［16］靈敏度低、檢測周期長，本課題組曾采用免疫法檢測嗜水氣單胞菌［17］，該法快速簡單，但其靈敏度和特異性與細(xì)菌抗體的質(zhì)量密切相關(guān)。常見的分子檢測手段如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）特異性強(qiáng)、靈敏度高［18］，但需昂貴的熱循環(huán)儀。而RCA 技術(shù)不僅具有分子檢測手段的優(yōu)點，且無需特殊的變溫設(shè)備，硬件限制少，此外還可進(jìn)行多靶標(biāo)、高通量檢測，操作簡單、反應(yīng)迅速。

2.1 細(xì)菌檢測

細(xì)菌是許多疾病的病原體，其檢測具有廣泛的應(yīng)用前景，RCA 技術(shù)可在較短時間內(nèi)實現(xiàn)極微量的分子檢測，并結(jié)合電泳［19］等手段進(jìn)行分析，獲得理想結(jié)果。近年來報道的RCA檢測細(xì)菌總結(jié)于表1。

表1 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)在細(xì)菌檢測中的應(yīng)用Table 1 Application of the RCA in bacteria detection

由表1 可見，直接RCA 法（未與其它技術(shù)聯(lián)用）簡便、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)，在細(xì)菌檢測領(lǐng)域發(fā)揮了獨有優(yōu)勢。黃冠軍等［20］根據(jù)柑桔潰瘍病菌（Xanthomonas axonopodispv. citri）獨有的蛋白基因設(shè)計鎖式探針，建立了柑桔潰瘍病的RCA檢測體系，靈敏度可達(dá)20 cfu/μL，高于常規(guī)的PCR法。且其它植物病原菌不干擾測定，特異性高。但該法需結(jié)合電泳檢測結(jié)果，步驟較為繁瑣。

跨越式滾環(huán)擴(kuò)增（Saltatory rolling circle amplification，SRCA）是近年來RCA研究的熱點，傳統(tǒng)RCA擴(kuò)增模板須是閉合環(huán)狀，但SRCA在Bst DNA聚合酶和引物作用下，沿靶序列擴(kuò)增，擴(kuò)增到靶序列兩端缺口時，通過添加堿基的方式跨越缺口，實現(xiàn)開環(huán)擴(kuò)增，如果再加一條模板鏈序列一致的引物，即形成SRCA的指數(shù)擴(kuò)增（圖3）［21］。這種方式無需鎖式探針和連接酶環(huán)化，操作步驟簡單，反應(yīng)過程縮短，檢測成本降低。同時由于其擴(kuò)增產(chǎn)物是雙鏈DNA，加入SYBR Green Ⅰ試劑即可直接實現(xiàn)結(jié)果的可視化。張?zhí)N哲等［21］利用SRCA檢測人工污染雞肉中沙門氏菌（Salmonella enterica），借助SYBR Green Ⅰ直接觀察檢測結(jié)果，檢出限為5.6 fg/μL。Milton 等［22］將SRCA、PCR 與實時定量PCR 法檢測沙門氏菌進(jìn)行對比，SRCA 法的檢測限最低，可達(dá)40 cfu/g。SRCA 法檢測嗜酸耐熱菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）［23］也被報道。

圖3 跨越式滾環(huán)擴(kuò)增原理［21］Fig.3 The principle of SRCA［21］

RCA 作為一種信號擴(kuò)增和放大技術(shù)，可與多種生物傳感器技術(shù)聯(lián)用，擴(kuò)增產(chǎn)物通過與帶有信號的標(biāo)記物相結(jié)合，實現(xiàn)擴(kuò)增信號的直接讀取，克服了直接RCA 法必須電泳才能查看結(jié)果的弊端（圖4），利用熒光法讀取結(jié)果，簡單方便，靈敏度高。Chen 等［24］將環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）與RCA 技術(shù)結(jié)合，采用分子信標(biāo)配對擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)射熒光，進(jìn)行鼠傷寒桿菌（Salmonella typhi）的實時檢測，檢測限為32 cfu/μL，該方法利用LAMP技術(shù)替代鎖式探針的環(huán)化過程，縮短了擴(kuò)增時間。Sun 等［25］利用金屬有機(jī)骨架化合物可吸附單鏈DNA 和猝滅熒光的能力，熒光的猝滅和恢復(fù)可通過對單鏈DNA的吸附和解吸實現(xiàn)，將其與RCA相結(jié)合，檢測大腸桿菌O157∶H7，方法的特異性強(qiáng)，檢出限可達(dá)40 cfu/mL。基于熒光檢測的RCA法也用于檢測克羅諾桿菌（Cronobacter spp）［26］，且顯著提高了檢測靈敏度。但熒光檢測需昂貴的儀器，且熒光容易被猝滅，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。比色生物傳感器儀器簡單，更適用于實時的現(xiàn)場檢測，但其靈敏度比熒光生物傳感器低，且比色讀取易受體系基質(zhì)干擾，產(chǎn)生誤讀。Zhang 等［27］開發(fā)了一種競爭性適配體生物傳感器，生物素標(biāo)記的RCA 引物通過鏈霉親和素連接在適配體上，適配體與單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）接觸后，利用競爭關(guān)系釋放出生物素標(biāo)記的引物引發(fā)RCA 反應(yīng)，形成生物素標(biāo)記的長單鏈DNA，與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的親和素反應(yīng)，生成生物素－親和素－HRP－DNA 產(chǎn)物，加入HRP反應(yīng)底物，通過吸光度確定單核增生李斯特菌的濃度。該方法設(shè)計新穎，利用適配體的競爭關(guān)系實現(xiàn)了檢測?；瘜W(xué)發(fā)光生物傳感器以化學(xué)發(fā)光的形式定量待測物含量，發(fā)光強(qiáng)度與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)速率相關(guān)，反應(yīng)速率與待測物相關(guān)，檢測成本低、快速、靈敏度高。Xu 等［28］結(jié)合適配體探針（Aptamererprobe，AP）、RCA 和切刻酶擴(kuò)增技術(shù)（Nicking enzyme amplification reaction，NEAR），在AP 探針和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）結(jié)合時，釋放出互補(bǔ)序列作為切刻酶擴(kuò)增反應(yīng)和RCA 反應(yīng)的引物，RCA 在互補(bǔ)序列的引發(fā)下形成大量G四鏈體（G4）結(jié)構(gòu)，與血紅素形成G4/血紅素復(fù)合物，催化H2O2完成魯米諾氧化，發(fā)出化學(xué)發(fā)光信號，可檢測低至5 cfu/mL 的金黃色葡萄球菌。RCA 有核酸原位擴(kuò)增的特點，可用來設(shè)計固相或半固相生物傳感器，與電化學(xué)信號轉(zhuǎn)換器相結(jié)合，具有靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)點，但該法需特定儀器，且對環(huán)境要求比較苛刻。Zhou等［29］開發(fā)了一種基于RCA、DNA walker的電化學(xué)生物傳感器，通過RCA擴(kuò)增產(chǎn)生多個重復(fù)序列，該重復(fù)序列與DNA walker探針互補(bǔ)形成多足DNA walker，通過金膜上電流信號檢測銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），最低可檢測10 cfu/mL。此外，Li等［30］也基于電信號輸出，設(shè)計了一種超靈敏的生物傳感器用于檢測大腸桿菌O157∶H7的靶基因，檢出限為7 cfu/mL。Aissa 等［31］采用磁珠收集濃縮大腸桿菌（Escherichia coli）DNA，通過測量電化學(xué)信號檢測大腸桿菌，檢測限為3.0×105cfu/mL。Kordas等［32］將RCA 技術(shù)與壓電式聲學(xué)傳感器結(jié)合，開發(fā)了一種無標(biāo)記的細(xì)菌檢測手段，并用于沙門氏菌的檢測，方法可在無特殊標(biāo)記的情況下利用傳感器對芯片的聲比率進(jìn)行檢測，從而有效檢出沙門氏菌的存在。Huang 等［33］另辟蹊徑，將RCA 技術(shù)和納米金探針以及紙基傳感器結(jié)合，檢測到最低100 pg/μL的總RNA，該方法造價低廉，且結(jié)果可視化，在現(xiàn)場檢測領(lǐng)域具有極大潛力。

除了傳感器讀取信號，Zhang 等［34］設(shè)計了一種新奇的結(jié)果可視化的RCA 方法，在磁珠上設(shè)計大腸桿菌O157∶H7 的核酸適配體，利用競爭關(guān)系釋放出RCA 引物，由此引發(fā)兩個部分互補(bǔ)的環(huán)狀序列進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，產(chǎn)生兩個長單鏈DNA，它們互相雜交，形成肉眼可見的DNA水凝膠，該方法對大腸桿菌O157∶H7的檢出限為4.0×103cfu/mL，1 h內(nèi)即可完成檢測，在食品安全檢測方面具有應(yīng)用潛力。

2.2 病毒檢測

病毒在食品中殘存時間較長，受污染的食品一旦被食用，會在體內(nèi)大量復(fù)制繁殖，造成感染。楊金宏等［35］采用直接RCA 對?；ㄈ~萎縮類病毒（Mulberry mosaic dwarf vrioid，MMDVd）的特異性基因設(shè)計鎖式探針，并結(jié)合凝膠電泳檢測，該方法可檢測到103拷貝。方法簡便快捷，且提高了檢測靈敏度和特異性。

RCA 同樣也常結(jié)合熒光傳感器用于病毒檢測，Jia 等［36］利用氧化石墨烯熒光猝滅的特性構(gòu)建了ssDNA 生物傳感器，當(dāng)檢測體系中存在埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）目的基因時，鎖式探針在酶的作用下成環(huán)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)酶處理后形成大量ssDNA，這些ssDNA 被裝有熒光素標(biāo)記肽的氧化石墨烯吸附后，與熒光素標(biāo)記肽結(jié)合產(chǎn)生大量dsDNA 復(fù)合物，導(dǎo)致氧化石墨烯對熒光素標(biāo)記肽的吸附力減弱，標(biāo)記肽解脫出來，恢復(fù)熒光，反之熒光素標(biāo)記肽被吸附在氧化石墨烯中，熒光猝滅。Hamidi 等［37］將RCA 與比色讀數(shù)相結(jié)合，DNA 聚合擴(kuò)增時釋放出大量焦磷酸分子，焦磷酸分子與Mg2+螯合后會使羥基萘酚藍(lán)（HNB）發(fā)生顏色變化，利用這種特性實現(xiàn)了對流感病毒H5N1（Influenza virus H5N1）的檢測，檢測限為7.6 fmol/L。結(jié)合電化學(xué)傳感器的RCA 檢測病毒也有報道，He 等［38］通過在電極表面修飾一層多孔牛血清白蛋白（BSA），改善捕捉探針在電極表面的分布，使探針位置分布更均勻，能更好地結(jié)合RCA 產(chǎn)物，產(chǎn)物和捕捉探針的結(jié)合改變了電極信號，基于此特性可用于人乳頭瘤病毒16 型（Human papillomavirus，HPV）的檢測。

Wang等［39］報告了一種基于固相RCA 檢測SARS病毒的方法，加入涂有低聚糖的磁珠，SARS－CoV 3′端上的多聚腺苷酸（Poly A）會與磁珠上的低聚糖結(jié)合，進(jìn)而通過磁鐵和磁珠將SARS的RNA從液體中分離出來，從而為RCA反應(yīng)提供有利條件，這種方式的檢測限可達(dá)單個拷貝。

2.3 其它病原微生物檢測

真菌在自然界廣泛存在，部分淺部真菌侵害皮膚表層和皮膚淺層，而一些深部真菌侵犯皮下組織、黏膜和內(nèi)臟，威脅生物體的生命健康。Najafzadeh 等［40］建立了外瓶霉（Exophiala；Exophiala isolates）的RCA檢測體系，可及時診斷由外瓶霉引起的大腦皮層真菌感染，為后續(xù)治療提供良好的依據(jù)。

支原體廣泛存在于人和動物體內(nèi)，無特定的形態(tài)，無細(xì)胞壁，可通過黏附作用和宿主的人細(xì)胞結(jié)合，釋放出大量氨，對細(xì)胞產(chǎn)生較大傷害。王輝等［41］對細(xì)胞污染支原體的16SrRNA、16S－23SrRNA間隔區(qū)和23SrRNA 的序列進(jìn)行blast比對，找出高保守序列設(shè)計5 種探針，并采用公共引物對其進(jìn)行RCA擴(kuò)增，凝膠電泳檢測，結(jié)果和PCR 法進(jìn)行比較，無交叉反應(yīng)，證明RCA 技術(shù)對于支原體的檢測是一種行之有效的手段。

部分藻類在生長過程中會分泌對水生動物、哺乳動物乃至人類有害的物質(zhì)，Liu等［42］針對劇毒卡爾藻（Karlodinium veneficum）設(shè)計了一種雙缺口滾環(huán)擴(kuò)增，該擴(kuò)增方式依靠兩個探針LP 和SP，LP 是兩端與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對的一段長單鏈序列，SP 是一段與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對的序列，且SP 的互補(bǔ)序列在LP兩端互補(bǔ)序列之間，只有兩端都與目標(biāo)序列互補(bǔ)配對后，才能在連接酶的作用下成環(huán)，結(jié)合橫向流試紙條技術(shù)可達(dá)到可視化檢測的需求。相同技術(shù)也可用于檢測海洋卡頓藻（Chattonella marina）［43］。如Nie 等［44］針對海洋卡頓藻設(shè)計了特異性鎖式探針，并進(jìn)行RCA 反應(yīng)，結(jié)果應(yīng)用反向斑點雜交技術(shù)進(jìn)行檢測，2 h 內(nèi)完成全部反應(yīng)，該方法可使用肉眼進(jìn)行觀察。此外米氏凱輪藻（Karenia mikimotoi）的檢測也已見報道［45］。針對有害藻的檢測可以有效避免赤潮和水華的產(chǎn)生，為生態(tài)治理提供預(yù)警。

3 總結(jié)與展望

RCA 相較于傳統(tǒng)的分子檢測手段如PCR 技術(shù)，具有高靈敏、高特異、恒溫擴(kuò)增的優(yōu)點，這使得RCA 不局限于實驗室使用，可望在養(yǎng)殖現(xiàn)場進(jìn)行實時檢測。但仍存在一些問題函待解決：①分子檢測的前提需提取核酸，但步驟繁瑣，樣品前處理復(fù)雜，檢測時間較長，限制了其應(yīng)用范圍；②RCA 擴(kuò)增后結(jié)果需結(jié)合電泳、熒光、電化學(xué)等儀器查看，不易直觀觀察得出結(jié)論；③探針設(shè)計、連接酶以及聚合酶的成本較高；④高通量檢測的優(yōu)點并未完全發(fā)揮出來。

據(jù)此我們認(rèn)為，RCA 檢測病原微生物可在以下方面開展相關(guān)工作：①簡化前處理步驟。目前水煮法［46］和自動化［47］提取核酸這種簡化方式為RCA 用于病原微生物的現(xiàn)場檢測提供了條件。②結(jié)合可視化技術(shù)［21］，比如通過與納米金、膠體金等聯(lián)用，使RCA 結(jié)果直接呈現(xiàn)，減少操作時間，結(jié)果更直觀，這是RCA 檢測規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)。③在探針設(shè)計、連接酶和聚合酶的選擇方面降低成本。如Nie等［44］以鎖式探針兩端檢測序列中間的連接序列為模板，特異性序列為引物合成探針來降低成本。④實現(xiàn)高通量檢測。鎖式探針的設(shè)計在保證中間連接序列不變的前提下，針對不同目標(biāo)序列設(shè)計不同的捕捉序列，用一對引物擴(kuò)增多種探針，以達(dá)到高通量檢測［37］的目的。

RCA 技術(shù)是一項便捷、靈敏、特異性強(qiáng)的快速檢測基因技術(shù)，繼續(xù)完善將使RCA 技術(shù)在病原微生物的檢測領(lǐng)域產(chǎn)生極大作用，同時也為新型冠狀病毒（SARS－CoV－2）的快速檢測提供思路和補(bǔ)充。