李 軻，張子宏，禹建鷹，連素梅，丁友超，謝堂堂，傅科杰，郭會清

(1.鄭州海關，河南 鄭州 450003；2.石家莊海關，河北 石家莊 050051；3.南京海關工業(yè)產(chǎn)品檢測中心，江蘇 南京 210001；4.深圳海關工業(yè)品檢測技術中心，廣東 深圳 518067；5.寧波檢驗檢疫科學技術研究院，浙江 寧波 315000)

大腸桿菌O157:H7(EscherichiacoliO157:H7)是腸桿菌科埃希氏菌屬的代表血清型，是一種人獸共患病原菌[1]。人畜感染劑量很低，危害嚴重，一般攝入10～100個活菌就能引起人的感染[2-3]，尤其極易感染4歲以下兒童[4-5]。它具有強烈的致病性與致死性，能夠引起出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥、血栓性血小板減少性紫癜[6]，已被世界衛(wèi)生組織確定為新發(fā)現(xiàn)的28種傳染病病原體之一[7-8]。

大腸桿菌O157:H7在自然環(huán)境中分布廣、數(shù)量多，因此，通常紡織品從生產(chǎn)到使用的任何環(huán)節(jié)都可能遭受該菌污染。該菌對環(huán)境抵抗力較強，耐酸耐低溫，紡織材料遭受該菌污染后，為適應生存環(huán)境，菌體通過增殖分泌胞外基質(zhì)，形成生物菌膜，成熟的菌膜可脫落釋放出細菌，這些細菌又可以形成新的生物被膜，使病原菌一直處于可存活但不可培養(yǎng)的自我保護狀態(tài)[9-10]，處于這種狀態(tài)的菌體仍然具有代謝活性和毒性表達[11-12]。細菌受菌膜保護，對外界環(huán)境的耐受性更強，工業(yè)清洗劑和消毒劑不易清除，成為潛在污染源，引發(fā)嚴重的生物安全問題[13-14]。

目前檢測大腸桿菌O157:H7的快速方法主要包括熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)方法、適配體技術和免疫學方法[15-17]等，現(xiàn)有的檢測方法已在食品領域成熟應用。而大腸桿菌O157:H7在食品和紡織品中生存環(huán)境不同，其基因全序列存在很大差異，紡織品和食品分屬獨立領域，2個領域的檢測方法無法通用。因此，迫切需要探索針對紡織品基質(zhì)檢測大腸桿菌O157:H7的技術，不用培養(yǎng)，靈敏、特異、快速、高效的檢測方法，以便于日常監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)可疑污染源，以及在發(fā)生公共衛(wèi)生事件時做出快速反應。

本研究選取大腸桿菌O157:H7特有的rfbE基因保守序列，設計PCR特異性引物和熒光雙標記探針，結(jié)合免疫磁珠技術，集成創(chuàng)新開發(fā)一種目標菌低濃度、不可培養(yǎng)情況下的樣品中高效、快速富集分離大腸桿菌O157:H7的技術，建立了一種針對紡織品基質(zhì)的免疫磁珠(immunomagnetic bead，IMB)富集-實時熒光PCR(real-time PCR)方法，其檢測下限可達8 CFU/mL，實現(xiàn)了紡織品中大腸桿菌O157:H7的快速靈敏鑒定，為紡織品污染該菌的檢測提供新的思路。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

實驗菌株:大腸桿菌O157:H7(ATCC 700728)、大腸桿菌O157:H7(ATCC 43888)、大腸桿菌O157:H7(CICC 21530)、大腸桿菌O157:H7(DC01-10紡織品中分離)、福氏志賀氏菌(CGMCC 1.186 8)、豬霍亂沙門氏菌(CICC 21493)、倫敦沙門氏菌(CMCC 50106)、單核細胞增生李斯特菌(CMCC 54002)、金黃色葡萄球菌(ATCC 29213)、銅綠假單胞菌(ATCC 15442)、空腸彎曲桿菌(CICC 22936)、副溶血性弧菌(ATCC 10782)、阪崎腸桿菌(IQCC10403)。

主要儀器:島津BioSpec-nano超微量分光光度計，美國賽默飛公司；CFX96熒光PCR儀，美國伯樂公司。

試劑:大腸桿菌O157:H7免疫磁珠分離檢測試劑，天津生物芯片技術有限責任公司；改良胰蛋白胨大豆肉湯(mTSB)、PCR緩沖溶液(10倍濃縮)、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP，10 mmol/L)、水生棲熱菌(Taq)DNA聚合酶(5U/μL)，北京陸橋公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物與探針設計

在GenBank中選取大腸桿菌O157:H7的rfbE(CP035 366.1)基因序列，利用Oligo7.0軟件，在沒有堿基變異的基因保守區(qū)段，設計PCR特異性引物和熒光雙標記探針，用分析軟件分析設計好的引物和探針序列的二級結(jié)構，并利用生物序列的相似性搜索工具BLAST分析其特異性，顯示引物和探針比較理想，特異性較好。設計好的序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，按說明用雙蒸水(ddH2O)稀釋成0.4 μmol/L，置于-20 ℃保存。

1.2.2 免疫磁珠富集

稱取25 g待檢樣品，剪碎，放入裝有225 mL mTSB肉湯培養(yǎng)基的均質(zhì)袋中均質(zhì)，41.5 ℃條件下放置5 h復壯樣品中的目標微生物。取出大腸桿菌O157:H7免疫磁珠，在漩渦振蕩器上振蕩10 s至磁珠全部重懸。取1支1.5 mL無菌離心管，分別吸取1 mL上述復壯后的mTSB培養(yǎng)基和20 μL大腸桿菌O157:H7免疫磁珠加入到離心管中，顛倒混合后將離心管放在搖床中，振蕩混合20 min。取下離心管，放入磁力架孔中，靜置3 min，吸棄管中液體。取1 mL洗脫緩沖溶液重懸磁珠，將離心管顛倒混勻5～8次，再置于磁力架孔中，靜置3 min，小心吸走多余液體。重復洗滌2次，最后加入50 μL洗脫緩沖溶液重懸磁珠。

上述實驗可根據(jù)需求做多個平行，多個平行得到的磁珠重懸液可混合到一起作為一個樣品進行下列實驗。

1.2.3 DNA模板制備

取富集好的重懸磁珠接種到10 mL已滅菌的mTSB培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)20 h，取增菌液用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA；也可不用培養(yǎng)，取重懸磁珠液直接按照試劑盒說明書進行模板制備，用島津BioSpec-nano超微量分光光度計測定其濃度和純度。

1.2.4 PCR反應體系和參數(shù)

PCR反應總體系體積為25 μL：PCR緩沖溶液2.5 μL，dNTP混合溶液1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，上、下游引物和探針各1 μL，DNA模板2 μL，其余用ddH2O補足。反應參數(shù)：37 ℃ 5 min，95 ℃ 預變性3 min；94 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸40 s，同時收集熒光,40個循環(huán)。

1.3 檢測體系優(yōu)化

1.3.1 引物優(yōu)化

引物和探針設計的目的是在擴增特異性和擴增效率之間取得平衡。根據(jù)大腸桿菌O157：H7 rfbE基因，設計2組引物及探針，探針5’端為FAM標記，3’端為TAMRA標記，如表1所示。

表1 2組引物參數(shù)Tab.1 Parameter of two sets of primers

取大腸桿菌O157:H7(ATCC 700728)、大腸桿菌O157:H7(ATCC 43888)、大腸桿菌O157:H7(CICC 21530)、大腸桿菌O157:H7(DC01-10紡織品中分離)菌液，稀釋至104倍，提取DNA模板，反應體系中分別加入2組引物，按1.2.4節(jié)反應參數(shù)擴增驗證2組引物、探針的擴增效率。

1.3.2 引物濃度優(yōu)化

利用1.3.1節(jié)中提取的菌液DNA，按照反應體系調(diào)整引物和探針量，如表2所示,總體系體積為25 μL，用滅菌ddH2O補足總體積，按照1.2.4節(jié)反應參數(shù)進行PCR擴增。

表2 體系中引物和探針各終濃度下對應的量Tab.2 Corresponding amount of primers and probes at each final concentration in system

1.3.3 模板量優(yōu)化

利用提取的菌液DNA,在擴增體系中分別設定模板量為1、2、3、4、5 μL，總反應體系體積為25 μL，不足量用滅菌ddH2O補足，進行PCR擴增反應。

1.3.4 退火延伸溫度優(yōu)化

利用提取的菌液DNA,分別設定擴增退火延伸溫度為56、58、60、62 ℃，其他反應參數(shù)不變，分別進行PCR反應擴增。

1.4 特異性實驗

取所有實驗菌株菌液提取DNA，進行PCR擴增。

1.5 靈敏性實驗

1.5.1 純培養(yǎng)物的靈敏度測試

取所有菌液各10 mL制成混合菌液，接種平板，培養(yǎng)后計數(shù)，原始菌液計數(shù)結(jié)果為8×109CFU/mL。將原始菌液進行倍比稀釋，選取濃度為8×105、8×104、8×103、8×102、80、8及0.8 CFU/mL 7個稀釋度提取DNA，進行PCR擴增，每個稀釋度進行4次平行測試。

1.5.2 添加目標菌的陽性樣品的靈敏度測試

選取上述濃度為80 CFU/mL的菌液，添加5份不同材質(zhì)的紡織品樣品(收集的已知大腸桿菌O157:H7陰性樣品，包括棉麻布1份、羊毛漿制品1份、絲制品1份、腈綸布1份、竹漿纖維制品1份)中，每個樣品添加1 mL，隔夜放置。提取DNA，進行PCR擴增,每個樣品做2個平行，重復3次測試。

1.6 檢出限驗證

市場采集7份紡織品樣品(包括滌/棉布1份、滌綸布1份、兔毛絨線1份、寶寶絨線1份、混紡平布1份、油布1份、帆布1份,經(jīng)過統(tǒng)一漂洗、晾曬、高壓滅菌處理后備用)，取中低濃度水平菌液(濃度為8 CFU/mL)1 mL人工添加上述5份樣品，選取高濃度水平菌液(菌液濃度為8×105CFU/mL)1 mL人工添加1份樣品，1份未添加做對照，所有樣品隔夜放置。取所有隔夜放置樣品分別提取DNA，連同1.5.2節(jié)中5份樣品共12個樣品DNA，一起進行PCR擴增測試，每個樣品做10個平行，同時用傳統(tǒng)方法進行驗證。

1.7 重復性實驗

取隔夜放置人工污染樣品培養(yǎng)液，提取DNA，進行PCR擴增測試，每個樣品做20個平行實驗，同時用傳統(tǒng)方法進行測試。

1.8 已知自然污染樣品檢測

取已知結(jié)果為陽性的自然污染樣品30份(6份來自某賓館的公用浴巾，10份來自某醫(yī)院的護士服、病號服，10份來自火車臥鋪的床單、被罩，4份來自某小區(qū)“依依不舍”捐贈衣服)，所有樣品先進行免疫磁珠富集，20份樣品培養(yǎng)后提取DNA、10份樣品直接用重懸磁珠提取DNA，每個樣品做2個平行，一并進行PCR擴增。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測體系優(yōu)化

2.1.1 引物優(yōu)化分析

2組引物的擴增結(jié)果見圖1。第1組引物擴增結(jié)果和預期結(jié)果100%相符，并且擴增開始時間(都在20 min內(nèi))早，擴增效率較高；第2組引物的擴增結(jié)果出現(xiàn)了假陰性和假陽性，開始擴增(30 min后)較晚，結(jié)果符合率較低，可能是因為引物中嘌呤和嘧啶含量相對較高的緣故。因此新建方法確定選擇第1組引物。

1—第1組引物；2—第2組引物。圖1 2組引物擴增曲線Fig.1 Amplification curve of two sets of primers

2.1.2 引物濃度優(yōu)化分析

引物濃度優(yōu)化結(jié)果如圖2所示。引物、探針濃度為0.2 μmol/L時，擴增曲線不明顯；引物、探針濃度為1.0 μmol/L時，由于引物濃度大，抑制擴增，擴增開始較晚，達到平臺期也較晚；引物、探針濃度為0.4、0.6、0.8 μmol/L時，擴增開始較早，擴增結(jié)束時都達到了平臺期，擴增曲線呈現(xiàn)明顯的S型，擴增效率都符合要求，0.8 μmol/L濃度時達到平臺期稍晚，擴增效率不如0.4、0.6 μmol/L濃度。綜合考慮試劑節(jié)約和擴增效率，PCR反應體系中引物和探針濃度選擇0.4 μmol/L。

1—0.2 μmol/L；2—0.4 μmol/L；3—0.6 μmol/L；4—0.8 μmol/L；5—1.0 μmol/L。圖2 引物與探針各終濃度時擴增曲線Fig.2 Amplification curve of primers and probes at different final concentrations

2.1.3 模板量優(yōu)化分析

擴增體系中模板量不同，結(jié)果差異很大，如圖3所示。當模板量為1 μL時，擴增效果最差，最先擴增出峰的模板上樣量為2 μL，其次是3、4、5 μL，在該 4個模板量條件下擴增效果都符合要求，而模板量為2 μL的擴增效率明顯更高，因此本方法擴增體系設定模板上樣量為2 μL。

1—1 μL；2—2 μL；3—3 μL；4—4 μL；5—5 μL。圖3 不同模板量擴增結(jié)果Fig.3 Amplification results of different templates

2.1.4 退火延伸溫度優(yōu)化

不同退火延伸溫度擴增效率差異很大，退火延伸溫度太低、太高肯定會影響引物的結(jié)合效率，在本實驗其他條件固定不變的情況下，60 ℃退火延伸溫度擴增效率最高。圖4示出退火延伸溫度為60 ℃時的擴增結(jié)果。本文選擇60 ℃為退火延伸溫度。

圖4 退火延伸溫度為60 ℃時的擴增結(jié)果Fig.4 Amplification results at 60 ℃

2.2 特異性分析

選擇標準菌株、紡織品分離株提取DNA，進行PCR擴增，結(jié)果見圖5。對13株不同來源的大腸桿菌O157:H7及分離株都能有效擴增，而非大腸桿菌O157:H7不能擴增，所建方法特異性符合要求。

圖5 特異性擴增曲線圖Fig.5 Specific amplification curve

2.3 靈敏性分析

2.3.1 純培養(yǎng)物的靈敏度分析

純培養(yǎng)物的靈敏性測試結(jié)果見圖6。樣液稀釋到大于80 CFU/mL時擴增明顯，稀釋到8 CFU/mL時，Ct值在30～35之間，結(jié)果為可疑；0.8 CFU/mL時擴增不明顯，判定陰性。取稀釋到8 CFU/mL的純培養(yǎng)物重復實驗，Ct值均在30～35之間，可判定陽性。

1—8×105 CFU/mL ；2—8×104 CFU/mL；3—8×103 CFU/mL；4—8×102 CFU/mL；5—80 CFU/mL；6—8 CFU/mL；7—0.8 CFU/mL圖6 7個稀釋度的擴增曲線圖Fig.6 Amplification curves of 7 dilutions

2.3.2 添加目標菌的陽性樣品的靈敏度測試

添加目標菌的陽性樣品的靈敏度測試結(jié)果如圖7 所示。選取不同材質(zhì)的紡織品做基質(zhì)樣品，當添加水平在80 CFU/mL樣品時，添加的目標菌測試結(jié)果和預期結(jié)果一樣。

圖7 添加目標菌的部分陽性樣品擴增曲線Fig.7 Amplification curve of some positive samples added with target bacteria

2.4 檢出限驗證

當添加水平在80 CFU/mL時，用傳統(tǒng)方法測試，檢出陽性概率為96%，用PCR方法測試時檢出陽性概率為100%。當添加水平在8 CFU/mL時，傳統(tǒng)方法測試檢出陽性概率為76%，用PCR方法測試時檢出陽性概率為90%，結(jié)果如表3所示。

表3 2種方法測試情況Tab.3 Test results of two methods

2.5 重復性試驗

采用中水平添加5種不同材質(zhì)紡織品，由測試結(jié)果可知采用傳統(tǒng)方法檢出概率為100%，PCR方法檢出概率為100%，2種方法結(jié)果無差異。結(jié)果見表4。

表4 5個樣品20個平行測試情況Tab.4 Parallel test of 20 samples of 5 samples

2.6 已知自然污染樣品檢測

所收集的30份陽性樣品分別來自部分公共場所，用傳統(tǒng)方法分離結(jié)果均為陽性；20份進行增菌培養(yǎng)后取增菌液提取DNA，10份直接用磁珠重懸液提取DNA，30份樣品全部進行PCR擴增，結(jié)果和預期結(jié)果符合，且每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct值)差異不明顯，結(jié)果見圖8。

圖8 自然污染樣品擴增結(jié)果Fig.8 Amplification results of natural pollution sample

3 結(jié)果與討論

目前國內(nèi)外對紡織品中大腸桿菌O157:H7沒有統(tǒng)一檢測的標準[18]，由于紡織品中的大腸桿菌O157:H7接近環(huán)境菌菌落特性，傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離鑒定有一定困難。且傳統(tǒng)方法操作繁瑣，檢測周期長，對于在環(huán)境中由于自我保護變異產(chǎn)生菌膜的細菌，特異性和靈敏性都有欠缺，易漏檢。免疫磁珠富集技術是一種具有高效、特異的樣品預處理方法，本研究應用的免疫磁珠表面偶聯(lián)有大腸桿菌O157:H7特異抗體，可與樣本中的大腸桿菌O157:H7的表面抗原進行特異性結(jié)合，磁珠在磁場作用下與樣本中的其他物質(zhì)快速分離，分離純度高，并保留目標病原菌生物活性，利于下游的檢測鑒別，是理想的樣品預處理方法[19]。實時熒光PCR技術是在PCR體系中引入熒光信號，利用熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR擴增反應每個循環(huán)產(chǎn)物量的變化[20]，該技術操作簡便，耗時短，特異性強。靈敏性、檢出限、重復性等技術參數(shù)驗證時均用了不同材質(zhì)的樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)天然纖維與合成纖維相比，PCR擴增時循環(huán)數(shù)略低，這可能是由于天然纖維營養(yǎng)豐富，菌體復壯迅速，由于PCR方法靈敏性和檢出限高于傳統(tǒng)方法，因此樣品材質(zhì)對實驗結(jié)果影響不大。

4 結(jié) 論

本文根據(jù)紡織品微生物污染的特殊性，利用免疫磁珠特異性富集技術結(jié)合熒光定量PCR特異性引物，建立了針對紡織品的實時熒光PCR體系，該方法具有雙重特異性，降低了結(jié)果誤判概率，其檢測下限可達8 CFU/mL。通過對自然污染樣品進行檢測發(fā)現(xiàn)，無論培養(yǎng)與否，富集重懸液提取DNA后擴增都能收集到目標熒光信號，且循環(huán)數(shù)(Ct值)無顯著性差異，與傳統(tǒng)方法相比，檢測效率提高60%。本研究所建立的技術方法能夠比較快速、準確、高效地鑒定紡織品中的大腸桿菌O157:H7，實用性較強，可應用于生物安全、公共衛(wèi)生安全等領域，為大腸桿菌O157:H7大規(guī)模流行病學調(diào)查提供技術支撐。