馬亞軍，劉笑凝，焦智慧，樸晨曦，徐嘉元，張千振，王洪斌 (東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高等學(xué)校動(dòng)物普通疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

肝缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)是一種病理生理應(yīng)激狀態(tài)，指肝臟的血液供應(yīng)被中斷，一定時(shí)間后重新恢復(fù)血供所引起的損傷。肝IRI對(duì)肝臟和全身性的影響在肝移植臨床應(yīng)用中具有重要意義[1]。肝IRI發(fā)生后，肝臟細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞因子分泌發(fā)生紊亂，活性氧(reactive oxygen species,ROS)、活性氮(reactive nitrogen species,RNS)大量產(chǎn)生，從而加重肝臟損傷。自噬是一種高度保守的生物過程，其通過清除降解受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為能量來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和活力[2]。肝臟在病理和生理學(xué)方面很大程度上依賴于自噬。自噬通常被認(rèn)為是一種細(xì)胞內(nèi)的自我保護(hù)機(jī)制，然而過度自噬卻會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[3-4]。在極端情況下，過度的自噬會(huì)導(dǎo)致自噬空泡的積累，從而使細(xì)胞死亡。肝臟缺血后，細(xì)胞內(nèi)ATP過度消耗、生成不足，AMPK活化，mTOR被抑制，自噬發(fā)生。此時(shí)自噬能夠幫助機(jī)體迅速適應(yīng)乏氧及營養(yǎng)不足的環(huán)境。再灌注時(shí)，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，ROS介導(dǎo)自噬過程中的多種信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致自噬進(jìn)一步增強(qiáng)，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡。PI3K/AKT通路在控制細(xì)胞生長、增殖、存活和代謝中起著重要作用，mTOR是細(xì)胞內(nèi)自噬的主要抑制因子，其哺乳動(dòng)物靶點(diǎn)受PI3K/AKT通路的正調(diào)控[5]。

隨著干細(xì)胞治療技術(shù)的深入研究，再生醫(yī)學(xué)治療尋求將非愈合性損傷引導(dǎo)至組織結(jié)構(gòu)和功能的完全恢復(fù)。干細(xì)胞再生療法最初的假設(shè)是基于干細(xì)胞分化功能，但有研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞的治療潛力可能不只是單獨(dú)來自于細(xì)胞分化和替代功能，還可能取決干細(xì)胞的旁分泌作用[6-7]。干細(xì)胞受其局部微環(huán)境、周圍細(xì)胞和干細(xì)胞的分泌物共同作用影響[8-9]，通過分泌一系列營養(yǎng)因子，如細(xì)胞因子、生長因子和趨化因子進(jìn)入微環(huán)境中，進(jìn)而控制細(xì)胞增殖、遷移和分化，并提供細(xì)胞保護(hù)[10-11]。本研究通過觀察肝IRI合并肝部分切除術(shù)術(shù)后3，7 d肝細(xì)胞自噬水平變化，探究脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分泌蛋白(adipose-derived mesenchymal stem cells-secretome,ADSCs-secretome)對(duì)于肝IRI合并肝部分切除肝細(xì)胞過度自噬損傷的修復(fù)作用，為進(jìn)一步無細(xì)胞產(chǎn)品代替細(xì)胞療法應(yīng)用到臨床提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4～6月齡廣西巴馬小型豬24頭，體質(zhì)量20～30 kg，在同等條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，且臨床及試驗(yàn)檢查健康。隨機(jī)分為4組：IRI組+saline對(duì)照組(IRI組)、IRI+DMEM對(duì)照組(DMEM組)、IRI+ADSCs-secretome干預(yù)組(ADSCs-sec組)、IRI+ADSCs干預(yù)組(ADSCs組)，每組6頭，雌雄各半。

1.2 主要試劑與儀器腹腔鏡、氣腹機(jī)(日本Olympus公司)，冷光源、高清內(nèi)窺鏡攝像系統(tǒng)(深圳市神州醫(yī)療設(shè)備有限公司)，腹腔鏡手術(shù)器械(日本Olympus公司)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(上海羅氏制藥有限公司)，電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國 Bio-Rad 公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(德國 Eppendorf 公司)。

注射用丙泊酚(西安力邦制藥有限公司)，小型豬復(fù)合麻醉劑(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)外科教研室研制)，異氟烷(河北一品制藥有限公司)，多聚甲醛試劑(武漢博士得生物有限公司)，胎牛血清(美國 CLARK 公司)，DMEM 低糖培養(yǎng)基(美國 Invitrogen 生命技術(shù)有限公司)，Beclin1、LC3Ⅱ、P62 抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)，p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR 抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司)。

1.3 小型豬ADSCs的體外分離培養(yǎng)在無菌條件下取豬脂肪組織，PBS洗滌、去筋膜、剪碎，與等體積的0.1% Ⅰ型膠原酶混合，37℃搖床中進(jìn)行酶消化45 min，終止消化，過濾，1 500 r/min離心10 min。棄上清，向沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液，充分裂解5 min 除去紅細(xì)胞,1 500 r/min離心5 min得到最終的細(xì)胞沉淀，培養(yǎng)液(DMEM，10% FBS，1%青鏈霉素和1%谷氨酰胺)重懸，吹勻，接種到培養(yǎng)瓶中，于37℃、5% CO2中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞約2 d完成貼壁。本試驗(yàn)使用P4代細(xì)胞。

1.4 ADSCs-secretome的制備ADSCs培養(yǎng)至P4代，待細(xì)胞全部鋪滿，棄去瓶中培養(yǎng)液，PBS清洗，換成無血清培養(yǎng)液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)。48 h后提取瓶中培養(yǎng)上清液。將提取的上清液1 500 r/min離心10 min，去除上清液中殘留的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。然后使用無菌過濾器進(jìn)行過濾，最后在無菌條件下放入3 KD超濾濃縮管中，5 000 r/min離心1 h進(jìn)行濃縮，濃縮比例約為24∶1，濃縮后的上清液-80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 建立手術(shù)模型進(jìn)行動(dòng)物保定，肌肉注射阿托品(0.05 mg/kg)，耳緣靜脈注射丙泊酚、小型豬復(fù)合麻醉劑(0.02 mg/kg)。確認(rèn)麻醉后，進(jìn)行氣管插管并連接呼吸麻醉機(jī)，進(jìn)一步維持麻醉。調(diào)適手術(shù)臺(tái)溫度在37℃左右。麻醉過程中，異氟烷濃度為2.5%～4%，氧流量0.8～1 L/min，呼吸頻率15～20次/min，潮氣量10～15 mL/kg，呼吸比1∶2，術(shù)中通過靜脈通路注射生理鹽水。

消毒手術(shù)部位，在小型豬腹部相應(yīng)位置插入套管(10 mm內(nèi)徑套管、5 mm內(nèi)徑套管各2個(gè))(圖1)。使用腹腔鏡器械，首先游離肝臟右葉根部膽囊管，使用止血帶穿過膽囊游離處，再從肝臟右葉基部兩側(cè)肝實(shí)質(zhì)處穿過，環(huán)住整個(gè)肝臟右葉。收緊止血帶，進(jìn)行肝臟右葉缺血處理，60 min后，松開止血帶，恢復(fù)右肝血供。采用三排縫合法對(duì)肝臟左葉進(jìn)行結(jié)扎。結(jié)扎完成后，切除肝臟左葉，檢查肝臟斷面出血情況，進(jìn)行止血處理。術(shù)后即刻，采用分點(diǎn)注射法向肝實(shí)質(zhì)注射相同劑量的相應(yīng)干預(yù)物。IRI組注射生理鹽水，DMEM組注射DMEM濃縮液，ADSCs組注射ADSCs重懸液，ADSCs-sec組注射ADSCs-secretome濃縮液。最后取出離斷肝臟組織，關(guān)閉氣腹，排出腹腔內(nèi)氣體，縫合外部創(chuàng)口。

A、B.10 mm內(nèi)徑套管；C、D.5 mm內(nèi)徑套管圖1 建立手術(shù)通路

于術(shù)前、術(shù)后3，7 d應(yīng)用腹腔鏡技術(shù)進(jìn)行組織樣本采集，于液氮中迅速冷凍后，-80℃保存，采集的組織樣本主要用于基因、蛋白檢測。

1.6 RT-qPCR檢測向組織樣本中加入TRIzol進(jìn)行研磨、裂解、試劑處理、離心、水浴提取總RNA,應(yīng)用超微量核酸檢測儀檢測RNA濃度與純度，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，最后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)與合成見表1。

表1 PCR引物序列

1.7 Western blot檢測在肝組織樣本中加入裂解液經(jīng)研磨、裂解、離心提取樣本總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度，使用Buffer(5×)進(jìn)行樣本處理，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、曝光檢測樣本目的蛋白含量。

1.8 免疫組化肝組織樣本經(jīng)固定、包埋、切片制成切片。處理好的切片依次進(jìn)行脫蠟、阻斷、抗原修復(fù)、封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、脫水、封片，最終在光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況，獲取圖片，并進(jìn)行圖片分析。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs-secretome對(duì)肝臟自噬相關(guān)基因的影響如圖2所示，與術(shù)前相比，術(shù)后3 d，IRI組與DMEM組肝組織中的Beclin-1、ATG5、ATG12 mRNA表達(dá)量均呈極顯著性上升(P<0.01)，p62 mRNA表達(dá)量呈極顯著性下降(P<0.01)；ADSCs-sec組與ADSCs組Beclin-1、ATG5、ATG12 mRNA表達(dá)量基本恢復(fù)至正常水平(P>0.05)，p62 mRNA 呈顯著性下降(P<0.05)；術(shù)后7 d，各分組中的Beclin-1、ATG5、ATG12、p62 mRNA表達(dá)水平已全部恢復(fù)至術(shù)前水平(P>0.05)。結(jié)果顯示，術(shù)后3 d，DMEM組與IRI組相比，Beclin1、ATG5、ATG12、p62 mRNA表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05)；ADSCs-sec組與DMEM組相比，Beclin1、ATG5、ATG12 mRNA表達(dá)水平明顯降低，p62 mRNA表達(dá)量明顯升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；ADSCs-sec組與ADSCs組相比，各自噬相關(guān)基因指標(biāo)結(jié)果無顯著性差異。術(shù)后7 d，4個(gè)分組數(shù)據(jù)顯示已無顯著性差異(P>0.05)。

A～D.分別為Beclin-1、ATG5、ATG12、p62在肝組織中的mRNA表達(dá)量變化；▲▲P <0.01，▲P < 0.05，與術(shù)前相比；##P < 0.01，與DMEM組相比圖2 自噬相關(guān)基因表達(dá)情況

2.2 ADSCs-secretome對(duì)肝臟自噬相關(guān)蛋白的影響如圖3所示，術(shù)后3 d，DMEM組與IRI組相比，Beclin1、LC3Ⅱ、p62蛋白表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)；ADSCs-sec組與DMEM組相比，Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平呈極顯著性降低(P<0.01)，p62蛋白表達(dá)水平呈極顯著性上升(P<0.01)；ADSCs-sec組與ADSCs組相比，Beclin1、LC3Ⅱ、p62蛋白表達(dá)水平無顯著性差異(P>0.05)。術(shù)后7 d，各組之間各自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。

A.自噬相關(guān)蛋白圖；B～D.分別為Beclin-1、LC3Ⅱ、p62在肝組織中的蛋白表達(dá)量變化；##P<0.01，與DMEM組相比圖3 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量

2.3 ADSCs-secretome對(duì)肝臟自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ影響的免疫組化結(jié)果如圖4，5所示，術(shù)后3 d，DMEM組與IRI組相比，LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)；ADSCs-sec組與DMEM組相比，LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量呈極顯著性降低(P<0.01)；ADSCs-sec組與ADSCs組相比，兩者無顯著性差異(P>0.05)。術(shù)后7 d，4組之間LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量已無顯著性差異(P>0.05)。

##P < 0.01，與DMEM組相比圖5 LC3Ⅱ蛋白表達(dá)情況

2.4 ADSCs-secretome對(duì)肝臟自噬通路PI3K/Akt/mTOR相關(guān)基因的影響由圖6可見，術(shù)前，各組PI3K、Akt、mTOR基因表達(dá)量較高。相比于術(shù)前，術(shù)后3 d，ADSCs組與ADSCs-sec組PI3K、Akt、mTOR mRNA已基本接近術(shù)前水平(P>0.05)，IRI組和DMEM組仍未恢復(fù)(P<0.01)；術(shù)后7 d，各組中PI3K、Akt、mTOR mRNA全部恢復(fù)至術(shù)前水平(P>0.05)。其中，結(jié)果顯示，術(shù)后3 d，DMEM組與IRI組之間無顯著性差別(P>0.05)；ADSCs-sec組PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)量顯著高于DMEM組(P<0.01)；ADSCs-sec組與ADSCs結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)。術(shù)后7 d，各組之間已無顯著性差異(P>0.05)。

A～C.分別為PI3K、Akt、mTOR在肝組織中的mRNA表達(dá)量變化；▲▲P<0.01，與術(shù)前相比；##P<0.01，與DMEM組相比圖6 自噬通路相關(guān)基因表達(dá)情況

2.5 ADSCs-secretome對(duì)肝臟自噬通路PI3K/Akt/mTOR相關(guān)蛋白的影響如圖7所示，術(shù)后3 d，DMEM組與IRI組中的p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值無顯著性差異(P>0.05)；ADSCs-sec組中的p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值顯著高于DMEM組(P<0.01)；ADSCs-sec組與ADSCs組之間無顯著性差異(P>0.05)。術(shù)后7 d，各組之間p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值均無顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 ADSCs-secretome對(duì)肝細(xì)胞自噬損傷后期修復(fù)的調(diào)節(jié)作用肝IRI是一種嚴(yán)重的并發(fā)癥，發(fā)生在低血容量休克、肝切除和肝移植過程中，會(huì)對(duì)患者的預(yù)后產(chǎn)生不利影響[12]。自噬在維持肝細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起著重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，自噬發(fā)生為細(xì)胞提供能量，旨在降低損傷程度，防止細(xì)胞死亡。然而，重度IRI卻會(huì)導(dǎo)致自噬過度增強(qiáng)，過度的自噬會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)正常的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷加重，甚至死亡。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，降低肝IRI術(shù)后過度自噬反應(yīng)能夠改善肝損傷，促進(jìn)肝臟修復(fù)[13-14]。有研究表明，肝IRI合并肝切除能夠引起肝細(xì)胞過度自噬，進(jìn)而加重了肝損傷[3-4]。然而，目前關(guān)于自噬的研究大多針對(duì)于肝IRI 24 h內(nèi)的自噬變化進(jìn)行觀察檢測，對(duì)于肝IRI細(xì)胞自噬后期變化知之甚少。針對(duì)這一問題，本試驗(yàn)對(duì)肝IRI術(shù)后3，7 d的樣本進(jìn)行提取、檢測。結(jié)果顯示，肝IRI術(shù)后3 d時(shí)，自噬表達(dá)仍處于較高水平，術(shù)后7 d，自噬水平恢復(fù)正常。因具有易獲得肝細(xì)胞分化潛力以及旁分泌效應(yīng)等優(yōu)勢，ADSCs已成為一種很有前途的缺血性肝臟疾病治療細(xì)胞。目前，有研究表明，基于ADSCs治療的組織修復(fù)主要?dú)w因于其旁分泌效應(yīng)，包括抗凋亡、促血管生成、抗炎作用和抑制纖維化[15-16]，而不是直接其分化作用。LEE等[17]研究發(fā)現(xiàn)ADSCs-secretome能夠減輕肝損傷，改善肝IRI后的肝臟微環(huán)境。此外，GE等[4]研究結(jié)果顯示，ADSCs移植能夠通過降低肝細(xì)胞過度自噬水平進(jìn)而減輕肝IRI造成的肝損傷。為進(jìn)一步探究了ADSCs旁分泌作用在肝IRI肝細(xì)胞過度自噬損傷修復(fù)中的調(diào)節(jié)作用，本試驗(yàn)對(duì)自噬相關(guān)因子Beclin-1、ATG5、ATG12、LC3Ⅱ、p62進(jìn)行了檢測，觀察ADSCs-secretome干預(yù)后，肝細(xì)胞自噬反應(yīng)的變化。結(jié)果顯示，與術(shù)前相比，術(shù)后3 d，IRI組與DMEM組肝組織中的Beclin-1、ATG5、ATG12 mRNA表達(dá)量均表現(xiàn)為顯著性升高，p62 mRNA表現(xiàn)為顯著性降低，以上結(jié)果表明，術(shù)后3 d時(shí)，肝IRI合并肝切除肝細(xì)胞過度自噬損傷仍未恢復(fù)。術(shù)后3，7 d，DMEM組與IRI組結(jié)果顯示均無明顯差異，結(jié)果表明，DMEM對(duì)肝IRI合并肝切除引起的肝細(xì)胞過度自噬損傷后期無調(diào)節(jié)作用，與生理鹽水無差別。術(shù)后3 d，ADSCs-sec組與DMEM組相比，肝細(xì)胞過度自噬損傷明顯得到緩解，ADSCs-sec組在術(shù)后3 d時(shí)，各自噬相關(guān)基因指標(biāo)已基本恢復(fù)至術(shù)前水平，以上結(jié)果表明，ADSCs-secretome能夠加快肝IRI合并肝部分切除引起的肝細(xì)胞過度自噬損傷修復(fù)。

3.2 ADSCs-secretome對(duì)肝細(xì)胞自噬損傷后期修復(fù)的調(diào)節(jié)機(jī)制研究表明，PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞自噬和凋亡均具有調(diào)節(jié)作用[18-20]。mTOR是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中雷帕霉素的分子靶標(biāo)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與代謝的重要因子，mTOR的活化可抑制自噬的表達(dá)。磷酸化的Akt可激活mTOR，mTOR則會(huì)抑制下游分子ULK1復(fù)合物從而負(fù)調(diào)節(jié)自噬反應(yīng)。結(jié)果顯示，與術(shù)前相比，術(shù)后3 d，IRI組與DMEM組肝組織中的PI3K、Akt、mTOR mRNA表達(dá)量均呈顯著性降低，自噬通路PI3K/Akt/mTOR受抑制。DMEM組與IRI組在術(shù)后3，7 d，PI3K/Akt/mTOR相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示無顯著差異，因此，DMEM對(duì)術(shù)后PI3K/Akt/mTOR通路無調(diào)節(jié)作用。術(shù)后3 d，與DMEM組相比，ADSCs-sec組中的PI3K、Akt、mTOR mRNA及p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白比值均呈顯著性升高，且與術(shù)前相比，術(shù)后3 d，ADSCs-sec組中的PI3K/Akt/mTOR相關(guān)基因結(jié)果顯示已無顯著性差別。結(jié)合以上自噬相關(guān)結(jié)果分析得出，ADSCs-secretome可能通過激活PI3K/Akt/mTOR通路從而促進(jìn)肝IRI合并肝部分切除引起的肝細(xì)胞過度自噬損傷修復(fù)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，肝IRI合并肝切除術(shù)后3 d時(shí)，肝細(xì)胞過度自噬仍未恢復(fù)，而ADSCs-secretome能夠加快肝IRI合并肝部分切除引起的肝細(xì)胞過度自噬損傷修復(fù)，且其修復(fù)機(jī)制可能是通過激活自噬負(fù)調(diào)控通路PI3K/Akt/mTOR進(jìn)行調(diào)節(jié)的。