呂觀新，王 海，武 瑞 (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院 獸醫(yī)臨床診斷與新獸藥研發(fā)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163319)

多形核中性粒細(xì)胞(poly-morphonuclear neutrophils,PMN)是奶牛體內(nèi)最豐富的循環(huán)粒細(xì)胞之一，在奶牛乳腺天然免疫中發(fā)揮著重要作用[1]。通常情況下，PMN游離于奶牛外周血中，僅少部分駐存在奶牛組織中。當(dāng)奶牛發(fā)生乳腺感染，病原菌聚集于乳腺腺泡腔內(nèi)分泌大量炎癥因子，此時(shí)，PMN將作為應(yīng)答向炎癥部位進(jìn)行募集。PMN從外周血中募集到炎癥部位是一個(gè)順時(shí)過程，包括：附著、滾動(dòng)、黏附和跨上皮遷移[2]。只有當(dāng)PMN跨過奶牛乳腺上皮進(jìn)入腺泡腔后，通過吞噬、釋放活性氧(ROS)和形成胞外誘捕網(wǎng)(NET)殺滅侵入病原菌，才能保證奶牛乳腺健康[3-5]。

非酯化脂肪酸(non-estesterified fatty acid,NEFA)是一類有機(jī)酸，主要由油酸(oleic acid,OA)、棕櫚酸(palmitic acid,PA)和硬脂酸(stearic acid,SA)等構(gòu)成。血清中NEFA的濃度與脂代謝、糖代謝及內(nèi)分泌功能密切相關(guān)[6-7]。足夠的能量攝入是奶牛發(fā)揮泌乳潛力的重要因素，但泌乳初期的奶牛由于內(nèi)分泌系統(tǒng)的變化，使自身干物質(zhì)攝入量下降，導(dǎo)致能量負(fù)平衡，此時(shí)機(jī)體會(huì)通過脂肪動(dòng)員來維持能量代謝平衡。

脂肪動(dòng)員是指儲(chǔ)存在脂肪組織中的脂肪，在一些脂肪酶的作用下逐步水解為NEFA和甘油并釋放進(jìn)入血液，被其他組織利用進(jìn)行氧化功能的過程[8]。NEFA是機(jī)體主要的儲(chǔ)備能量，圍產(chǎn)期奶牛的高能量需求會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)脂肪動(dòng)員。此時(shí)，奶牛體內(nèi)大量的NEFA不能被完全氧化分解，進(jìn)而造成奶牛氧化應(yīng)激[9]。近年來，NEFA與PMN功能之間的作用關(guān)系受到了越來越多的關(guān)注。CROOKENDEN等[10]對(duì)高NEFA濃度奶牛中分離出的PMN進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞募集、干擾素信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因下調(diào)，表明發(fā)生代謝應(yīng)激的圍產(chǎn)期奶牛PMN功能受損，奶牛體內(nèi)NEFA濃度過高會(huì)對(duì)先天免疫系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)面影響，并可能導(dǎo)致圍產(chǎn)期奶牛免疫抑制狀態(tài)的發(fā)生。HAMMON等[11]在研究圍產(chǎn)期奶牛外周血PMN功能、能量狀態(tài)和子宮健康之間的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，血液中NEFA含量顯著升高和干物質(zhì)采食量下降后，能量負(fù)平衡奶牛的PMN殺菌能力顯著受損。ZERBE等[12]在研究肝臟甘油三酯含量與PMN功能關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，從甘油三酯含量高的奶牛中分離出的PMN趨化和吞噬功能受損，呼吸暴發(fā)產(chǎn)生的ROS量也顯著下降，這可能有助于解釋能量負(fù)平衡奶牛子宮內(nèi)膜炎的患病率更高的原因。CARRILLO等[13]研究發(fā)現(xiàn)OA可以誘導(dǎo)人PMN活化并通過鈣信號(hào)介導(dǎo)ROS產(chǎn)生。

綜上所述，圍產(chǎn)期奶牛持續(xù)加劇的能量負(fù)平衡狀態(tài)使奶牛體內(nèi)NEFA濃度不斷升高，對(duì)PMN功能產(chǎn)生不利影響，這可能是圍產(chǎn)期奶牛更易患傳染性疾病如乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎等疾病的原因。目前對(duì)于NEFA和PMN遷移功能方面的研究較少。因此，本研究擬通過體外構(gòu)建Transwell跨乳腺上皮遷移模型，并以此模型研究不同濃度的OA、PA及SA對(duì)PMN遷移功能的影響，為通過奶牛天然免疫系統(tǒng)防控奶牛乳腺炎提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自黑龍江省安達(dá)市某規(guī)?；翀?chǎng)隨機(jī)選取健康且處于泌乳期的奶牛。

1.2 主要試劑DMEM/F12培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；Transwell 24孔通透性嵌套(3.0 μm)和膠原蛋白(Collagen Ⅰ)購自Corning公司；PMN趨化肽N-Formyl-Met-Leu-Phe(fMLP)購自Sigma公司；牛外周血中性粒細(xì)胞分離Kit購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；胰蛋白酶、DMSO和Hank's緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司；硬脂酸鈉溶液、油酸鈉溶液和棕櫚酸鈉溶液購自西安鯤創(chuàng)科技發(fā)展有限公司。

1.3 Transwell跨乳腺上皮遷移模型構(gòu)建MAC-T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)與凍存。將MAC-T細(xì)胞從液氮中取出，37℃水浴解凍。吸取細(xì)胞液至15 mL離心管中并加入等體積的DMEM/F12完全培養(yǎng)基(含10% FBS，青霉素/鏈霉素100 mg/L)，1 500 r/min離心3 min，收集沉淀。加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸混勻細(xì)胞，以1×106/mL接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充完全培養(yǎng)基至5 mL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至培養(yǎng)瓶底達(dá)90%時(shí)，棄去瓶內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS洗滌2～3次，加入2 mL 0.25%胰酶，室溫或置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃消化。待鏡下觀察細(xì)胞變圓且有部分脫落時(shí)，加入4 mL完全培養(yǎng)基終止消化，按1∶2傳代培養(yǎng)；用乙酸(0.006 mol/L)將Collagen Ⅰ稀釋至0.012 mg/L，將Transwell嵌套倒置于無菌培養(yǎng)皿上，將稀釋好的Collagen Ⅰ均勻鋪在面積為0.33 cm2的Transwell嵌套底膜后，將培養(yǎng)皿置于生物安全柜中靜置過夜風(fēng)干。將先前培養(yǎng)生長狀況良好的MAC-T(1×105個(gè))接種于包被有Collagen Ⅰ的Transwell嵌套底膜，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中6 h，取出平皿用Hank's液沖洗嵌套底面去除未貼壁細(xì)胞；用無菌鑷子將Transwell嵌套正置放入24孔板中，向Transwell嵌套中加入200 μL完全培養(yǎng)基，對(duì)應(yīng)孔中加入500 μL完全培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待鏡下觀察細(xì)胞生長至底膜達(dá)90%時(shí)，將嵌套取出并用Hank's液沖洗2～3次后移回24孔板。

1.4 PMN分離與鑒定隨機(jī)挑選奶牛進(jìn)行尾根靜脈采血至含枸櫞酸鈉的一次性負(fù)壓采血管中。備好15 mL離心管，做好標(biāo)記，每管先加入4 mL PMN分離試劑A，后加入2 mL PMN分離試劑C；吸取1 mL 外周血緩慢加于分離液C上層，2 500 r/min離心30 min；取新離心管，將第2層乳白色環(huán)狀細(xì)胞層吸出到新離心管中，再加入適量紅細(xì)胞裂解液1 500 r/min離心10 min，重復(fù)1～2次直至無紅細(xì)胞殘留；棄上清用Hank's液洗滌2～3次，1 500 r/min 離心10 min，最后底部沉淀用1 mL RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸混勻，用Trypan blue染色后用于PMN活性鑒定，并用Countess細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；用DAPI染色后用熒光顯微鏡進(jìn)行PMN純度鑒定。

1.5 NEFA對(duì)PMN跨奶牛乳腺上皮細(xì)胞遷移功能的影響用DMSO將PMN趨化肽fMLP稀釋至10 μmol/L，再將油酸鈉溶液、棕櫚酸鈉溶液和硬脂酸鈉溶液用去離子水稀釋，使油酸鈉溶液使用濃度分別為0.130，0.260，0.520 mmol/L，棕櫚酸鈉溶液使用濃度分別為0.1，0.2，0.4 mmol/L，硬脂酸鈉溶液使用濃度分別為0.04，0.08，0.16 mmol/L。取12個(gè)Transwell嵌套至24孔板中，每12孔為一組，其中前6孔作為空白對(duì)照組，其余6孔作為不同濃度的NEFA組分的試驗(yàn)組，每組重復(fù)檢測(cè)3次。向每個(gè)嵌套中依次加入100 μL PMN(1×105個(gè))，并向空白對(duì)照組嵌套加入100 μL RPMI 1640完全培養(yǎng)基，試驗(yàn)組嵌套加入100 μL各使用濃度的NEFA組分。依次向嵌套對(duì)應(yīng)孔中加入990 μL RPMI 1640完全培養(yǎng)基及10 μL fMLP(10 μmol/L)，使孔中fMLP終濃度為100 nmol/L。將放有Transwell嵌套的24孔板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。將24孔板取出并移除Transwell嵌套，將孔中液體反復(fù)吹打混勻后，每孔收集300 μL液體到流式專用管中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 Transwell跨乳腺上皮遷移模型構(gòu)建對(duì)MAC-T進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，顯微鏡下觀察可見細(xì)胞均勻分布于培養(yǎng)瓶中，部分開始貼壁生長(圖1A)；繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，可見培養(yǎng)瓶底面呈典型上皮細(xì)胞樣的細(xì)胞，生長面積達(dá)95%以上(圖1B)；在Transwell嵌套底面接種MAC-T，6 h后可見大部分MAC-T已貼壁生長(圖1C)；繼續(xù)培養(yǎng)至48 h時(shí)，觀察底面可見MAC-T生長狀況良好，已覆滿整個(gè)底面，可用于后續(xù)試驗(yàn)(圖1D)。

A.剛復(fù)蘇的MAC-T細(xì)胞；B.貼壁后的MAC-T細(xì)胞；C.接種MAC-T細(xì)胞 6 h；D.接種MAC-T細(xì)胞 48 h圖1 MAC-T細(xì)胞在Transwell嵌套底膜的培養(yǎng)(100×)

2.2 PMN活性及純度鑒定結(jié)果如圖2所示，PMN存活率大于95%，純度大于90%，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

圖2 PMN活性及純度鑒定

2.3 NEFA對(duì)PMN跨奶牛乳腺上皮細(xì)胞遷移功能的影響用不同濃度PA、SA和OA分別刺激PMN后，分別收集對(duì)應(yīng)孔300 μL液體到流式專用管中，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，PA和SA對(duì)PMN跨乳腺上皮遷移數(shù)量并無顯著影響(P>0.05)(圖3A、B)；但不同濃度的OA可顯著促進(jìn)PMN跨乳腺上皮遷移數(shù)量(P< 0.01)，其作用特點(diǎn)呈劑量依賴效應(yīng)(圖3C)。結(jié)果表明，NEFA的不同組分對(duì)PMN跨乳腺上皮遷移能力具有不同影響，其中，OA可以呈劑量依賴形式，促進(jìn)PMN跨乳腺上皮遷移。

*表示與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.05)；**表示與空白對(duì)照差異極顯著(P<0.01)；無*表示與空白對(duì)照組差異不顯著圖3 PA、SA及OA對(duì)PMN跨奶牛乳腺上皮遷移功能的影響

3 討論

健康奶牛體內(nèi)NEFA濃度不高于0.4 mmol/L，泌乳初期的奶牛通過干物質(zhì)采食所攝取的能量不能滿足全部能量需求，機(jī)體需要通過脂肪動(dòng)員來維持能量代謝平衡[14]。圍產(chǎn)期奶牛的高能量需求會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)脂肪動(dòng)員，奶牛體內(nèi)大量的NEFA不能被完全氧化分解，進(jìn)而造成奶牛氧化應(yīng)激[15]。有研究表明，NEFA的不完全氧化是導(dǎo)致圍產(chǎn)期奶牛免疫功能降低，患病風(fēng)險(xiǎn)升高的關(guān)鍵因素之一[16]。以往NEFA與PMN功能的研究集中在PMN趨化性、吞噬功能和ROS產(chǎn)生方面，而尤為重要的PMN遷移功能方面的研究較少[10-12]。

因此，本試驗(yàn)構(gòu)建Transwell跨乳腺上皮遷移模型，體外研究了不同濃度的OA、PA及SA對(duì)PMN遷移功能的影響。結(jié)果表明，PA和SA對(duì)PMN跨乳腺上皮遷移功能并無顯著影響，各濃度OA對(duì)PMN遷移功能均具有極顯著的促進(jìn)作用，造成這種現(xiàn)象的原因可能是PMN表面存在游離酸脂肪受體-1(GPR40)，OA可通過GPR40并以劑量依賴方式調(diào)節(jié)PMN細(xì)胞內(nèi)的鈣動(dòng)員，并以此增強(qiáng)了PMN遷移功能[17]。有研究表明，OA可通過活化蛋白激酶ERK信號(hào)通路促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，Ca2+的升高直接影響F-肌動(dòng)蛋白骨架重塑以及遷移過程中的整聯(lián)蛋白信號(hào)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)PMN遷移功能[18-19]。綜上所述，NEFA不同組分對(duì)奶牛PMN遷移功能具有不同的影響，OA可以促進(jìn)PMN跨乳腺上皮遷移能力，提示通過改善飼料成份和配比，提高OA在奶牛體內(nèi)NEFA中的占比，可能有助于防治奶牛乳腺炎。