白雨曼，李鑫潤，廖建昭，劉德琴，霍海花，王書舟，楊 帆，馬飛洋, 唐兆新*，郭劍英* (.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 5064；.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物群發(fā)性疾病監(jiān)測與防控研究所，江西 南昌 330045)

銅(Cu)是動物機(jī)體的必需微量元素，在生物體的細(xì)胞呼吸、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、抗氧化應(yīng)激和鐵離子的攝取等許多重要生理過程起著重要的作用[1]。但過度的銅攝入會引起各器官出現(xiàn)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、代謝紊亂等問題[2-4]，影響其正常功能作用甚至損傷器官。腸道菌群的多樣性能夠保證腸道微生物區(qū)系平衡，維持胃腸道環(huán)境相對穩(wěn)定，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收[5]。腸道銅穩(wěn)態(tài)具有博弈性，一方面,銅是多種氧化還原酶的輔助因子并參與腸道細(xì)胞有氧呼吸、其他金屬元素的代謝過程：另一方面,過量的銅通過催化芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的超陰負(fù)離子與過氧化氫合成有毒的羥基自由基[6]。因此對白羽肉雞進(jìn)行高銅日糧飼喂所導(dǎo)致的腸道銅穩(wěn)態(tài)紊亂，可以很大程度影響機(jī)體對脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的吸收和代謝，BELIZARIO等[7]認(rèn)為腸道菌群的豐度和多樣性是正常代謝和免疫功能的體現(xiàn)。而雞腸道中微生物最活躍的器官是盲腸，從小腸下行的物質(zhì)約有10%進(jìn)入盲腸[8]。本試驗(yàn)利用Illumina MiSeq測序平臺，對對照組和高銅組中白羽肉雞盲腸內(nèi)容物中微生物16S rDNA V4區(qū)序列進(jìn)行測定，并對其菌落結(jié)構(gòu)多樣性和豐度進(jìn)行分析，結(jié)合其代謝通路預(yù)測以及組織學(xué)觀察，探究高銅日糧的攝入對肉雞盲腸及其微生物的影響，以期為高銅對肉雞毒理學(xué)相關(guān)研究提供一定的生物學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及處理1日齡艾拔益加(AA)商品代白羽肉雞120羽(平均體質(zhì)量43 g)，購自廣東省東莞市塘廈鎮(zhèn)。肉雞采用籠養(yǎng)方式養(yǎng)殖，飼養(yǎng)過程中所有肉雞均進(jìn)行常規(guī)免疫，肉雞自由飲水和采食。本試驗(yàn)選用無水硫酸銅作為銅源，基礎(chǔ)日糧的銅含量按照NRC(1994)建議的11 mg/kg，另外根據(jù)YANG等[9]的研究設(shè)置高銅日糧組，含銅量為330 mg/kg(高銅組)。在其他條件相同下飼喂至49日齡經(jīng)翅靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉后，剖開腹腔并采集盲腸及盲腸內(nèi)容物，一部分盲腸經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃保存，另一部分采用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行組織固定，盲腸內(nèi)容物經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃保存，送至上海烈冰生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2 主要試劑無水硫酸銅(分析純)購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；肉雞全價(jià)基礎(chǔ)飼料購自廣州花都某飼料廠；多聚甲醛(paraformaldehyde)購自Sigma公司；切片石蠟、中性樹膠購自國藥集團(tuán)公司；TRIzol、PrimeScript RT Master Mix購自TaKaRa公司；2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 樣本組織總銅檢測取盲腸組織100 mg，用濃硝酸與過氧化氫在沸水浴的作用下，對組織消解30 min直至液體澄清透明，消化冷卻至室溫。樣品消化后過濾到50 mL容量瓶中，用5%稀硝酸定容，搖勻，待測。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜ICP-MS火焰分析法分析銅的含量，銅的測定線為324.75 nm，火焰類型為空氣-乙炔焰。將銅元素標(biāo)準(zhǔn)儲備液進(jìn)行梯度稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)液，通過原子吸收儀測定標(biāo)準(zhǔn)液的吸光值以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測樣品所測得的吸光值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出樣品的銅濃度。

1.4 樣本病理組織觀察取新鮮盲腸組織經(jīng)生理鹽水輕緩沖洗之后，浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h 后，經(jīng)流動自來水沖洗過夜，進(jìn)行梯度酒精脫水、透明、透蠟和石蠟包埋，待蠟塊自然凝固之后。進(jìn)行切片、蘇木精-伊紅染色、中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡觀察盲腸組織的病理學(xué)變化。

1.5 盲腸內(nèi)容物高通量測序檢測將樣本送至上海烈冰生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測序：首先提取盲腸內(nèi)容物組樣本DNA，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，使用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對樣本進(jìn)行16S rDNA的V4區(qū)域 PCR擴(kuò)增，并構(gòu)建PE擴(kuò)增文庫。對Illumina NovaSeq 測序得到的下機(jī)數(shù)據(jù)(Raw PE)進(jìn)行拼接和質(zhì)控，得到Clean Tags，再進(jìn)行嵌合體過濾，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)。為研究各樣本的物種組成，對所有樣本的Effective Tages以97%的一致性進(jìn)行Operational Taxonomic Units(OTUs)聚類，然后對OTUs的序列進(jìn)行物種注釋。最后對盲腸內(nèi)容物中微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性、蛋白功能及代謝通路功能的變化進(jìn)行預(yù)測分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析用Office Excel軟件將處理好的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)，并用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析以及差異顯著性檢驗(yàn)和多重比較。用GraphPad Prism 6.0軟件作圖。*表示P<0.05(差異顯著)，**表示P<0.01(差異極顯著)。

2 結(jié)果

2.1 日糧中銅含量不同對肉雞盲腸中銅含量的影響如圖1所示，與對照組相比，高銅組盲腸中銅含量極顯著升高(P<0.01)。

與對照組相比，*表示 P<0.05，**表示P<0.01。下同圖1 日糧中銅含量不同對肉雞盲腸中銅含量的影響

2.2 高銅對肉雞盲腸組織學(xué)變化的影響結(jié)果顯示，盲腸組織并未發(fā)生明顯的病變(圖2)；由圖3可見，與對照組相比，高銅組盲腸絨毛高度顯著降低(P<0.05)，隱窩深度顯著增高(P<0.05)，絨毛高度與隱窩深度比值極顯著降低(P<0.01)。

A.對照組；B.高銅組圖2 盲腸的組織學(xué)形態(tài) (400×)

A～C.分別為肉雞盲腸絨毛高度、隱窩深度及絨毛高度和隱窩深度的比值圖3 高銅日糧對肉雞盲腸結(jié)構(gòu)的影響

2.3 16S rDNA測序結(jié)果結(jié)果顯示，共從盲腸內(nèi)容物中獲得有效序列490 872條，其中487 610條高質(zhì)量序列，149 88個OTUs，滿足后續(xù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析要求。

2.4 Alpha Diversity分析Alpha多樣性(樣本內(nèi)多樣性)是指一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，常用的度量指標(biāo)有Chao1 豐富度估計(jì)量(chao1 richness estimator)、香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)(shannon-wiener diversity index)、辛普森多樣性指數(shù)(simpson diversity index)等。測量數(shù)據(jù)如表1所示，對照組與高銅組的樣品豐度和多樣性相差不大，但高銅組菌種的多樣性相比對照組有明顯的下降趨勢。

表1 多樣性指數(shù)

如圖4所示，Chao1曲線表明所測樣品中預(yù)測物種多樣性很多；當(dāng)Shannon指數(shù)為5～7時，Simpson指數(shù)為0.9～1.0時，曲線趨于平緩，表明各樣本從隨機(jī)抽取的測序條數(shù)發(fā)現(xiàn)的物種趨于飽和，即檢測到了近乎全部的OTUs。數(shù)據(jù)可靠且全面。

橫坐標(biāo)均為隨機(jī)抽取的序列數(shù)圖4 樣品Chao1曲線(A)、Shannon曲線(B)和Simpson曲線(C)

2.5 高銅在門水平上對肉雞盲腸微生物多樣性的影響試驗(yàn)進(jìn)行49 d時，飼喂高銅日糧在門水平上對肉雞盲腸微生物多樣性的影響如圖5所示，即與對照組相比，高銅組中的柔膜菌門(Tenericutes)含量顯著升高(P<0.05)，而厚壁菌門(Firmicutes)細(xì)菌的含量顯著降低(P<0.05)。

圖5 試驗(yàn)49 d基于門水平高銅組與對照組的比較

2.6 高銅在科水平上對肉雞盲腸微生物多樣性的影響試驗(yàn)進(jìn)行49 d時，飼喂高銅日糧在科水平上對肉雞盲腸微生物多樣性的影響如圖6所示，與對照組相比，高銅組中的紅螺菌科(Rhodospirillaceae)含量極顯著升高(P<0.01)，同時腸桿菌科(Enterobacteriaceaae)含量顯著升高(P<0.05)；而韋榮球菌科(Erysipelotrichaceae)細(xì)菌的含量顯著降低(P<0.05)。

圖6 試驗(yàn)49 d基于科水平高銅組與對照組的比較

2.7 高銅對肉雞盲腸微生物(屬水平)的影響試驗(yàn)進(jìn)行49 d時，飼喂高銅日糧在屬水平上對肉雞盲腸微生物多樣性的影響如圖7所示，與對照組相比，高銅組中的另枝菌屬(Alistipes)含量顯著升高(P<0.05)；而厭氧棍狀菌屬(Anaerotruncus)，瘤胃梭菌屬(Ruminiclostridium)細(xì)菌的含量卻顯著降低(P<0.05)。

圖7 試驗(yàn)49 d基于屬水平高銅組與對照組的比較

2.8 高銅對肉雞盲腸微生物代謝通路的影響KEGG分析如圖8所示，試驗(yàn)49 d，飼喂高銅日糧對肉雞盲腸微生物代謝通路產(chǎn)生的影響，高銅組與對照組相比蛋白所參與到的32個代謝通路因子有顯著性差異(P<0.05)，高銅組與氧化磷酸化相關(guān)的p53信號通路(p53 signaling pathway)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)及與營養(yǎng)代謝相關(guān)的甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(glycine,serine and threonine metabolism)、脂肪酸代謝(fatty acid metabolism)、蛋白質(zhì)外排(protein export)、DNA修復(fù)和重組蛋白(DNA repair and recombination proteins)等代謝通路因子顯著升高(P<0.05)；但礦物質(zhì)吸收(mineral absorption)、D-丙氨酸代謝(D-alanine metabolism)、蛋白激酶(protein kinases)、苯丙氨酸代謝(phenylalanine metabolism)等通路因子顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明，飼喂高銅日糧會改變?nèi)怆u盲腸菌群代謝通路因子。

圖8 高銅組與對照組樣品微生物KEGG的比較

3 討論

銅是動物機(jī)體的必需微量元素之一，其參與機(jī)體多種生理生化過程[10]。在飼料中添加銅可促進(jìn)畜禽生長，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用其作為飼料添加劑使用，但銅攝入過量會對機(jī)體造成危害。近年，由于重金屬排放問題的加重以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中濫用越發(fā)明顯，銅對環(huán)境、農(nóng)業(yè)污染的報(bào)道屢見不鮮[11-12]。前期研究表明，攝入高銅會誘發(fā)肉雞的肝臟以及消化器官不同程度的損傷[13-15]。腸道作為禽類消化最集中的部位，主司食物消化和吸收功能，盲腸微生物菌群的構(gòu)建時間相對來說較為延后，大概在生長發(fā)育6～7周后完成構(gòu)建。食物進(jìn)入消化道，經(jīng)一系列消化過程，最終在盲腸和直腸停留，此處的細(xì)菌數(shù)量巨大[16]。日糧中的銅被腸道吸收后會以銅藍(lán)蛋白形式滯留在腸道中，并結(jié)合蛋白小分子轉(zhuǎn)運(yùn)到其他系統(tǒng)器官中，而超過吸收范圍的小部分銅就存蓄在腸道黏膜細(xì)胞中[17]，剩余部分將隨糞便排出體外。本研究對盲腸組織中總銅含量檢測發(fā)現(xiàn)，高銅組組織銅含量相比對照組顯著升高，說明銅能滯留在盲腸組織中。

動物消化道存在著數(shù)目龐大且種類豐富的微生物，這些微生物組成的群落在動物的營養(yǎng)、免疫、生理和代謝等方面發(fā)揮著巨大作用[18]。腸道內(nèi)微生物是環(huán)境依賴型[19],因此肉雞盲腸內(nèi)微生物豐度的改變可能由盲腸結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致。腸絨毛高度、隱窩深度以及兩者的比值是評價(jià)畜禽發(fā)育、營養(yǎng)水平的一個指標(biāo)[20]，絨毛越高說明腸上皮細(xì)胞發(fā)育程度越完整，對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力越強(qiáng)；隱窩則代表上皮細(xì)胞成熟率，越淺代表成熟率越高；兩者的比值降低代表消化功能降低[21]。在現(xiàn)有的研究背景下，銅對腸道絨毛形態(tài)的影響結(jié)論不一，SHURSON等[22]認(rèn)為高銅可以增加隱窩深度。王艷華[23]卻提出納米銅和高水平硫酸銅能夠增加斷奶仔豬腸絨毛高度。而RADECKI等[24]研究表明，飼喂250 mg/kg硫酸銅不會對斷奶仔豬腸絨毛高度、隱窩深度產(chǎn)生明顯影響。本試驗(yàn)中高銅組與對照組相比，盲腸絨毛高度有所下降，且隱窩深度也有所增加，而絨毛高度與隱窩深度的比值顯著下降。這說明飼喂高銅日糧會改變盲腸的腸道結(jié)構(gòu)，并可導(dǎo)致肉雞對食物消化吸收的能力降低。

銅雖然可以促進(jìn)動物的生長，但隨著銅的不斷攝入并在腸道蓄積，將會改變腸道菌群的組成使腸道內(nèi)菌群失衡。ZHANG等[25]研究發(fā)現(xiàn)銅的攝入改變了盲腸微生物群落的組成，增加了腸道大腸桿菌的抗藥性，并且可能在斷奶后早期損害仔豬的健康。本研究通過 Illumina-Hiseq 高通量測序平臺對對照組及高銅組的 12 羽白羽肉雞的盲腸內(nèi)容物進(jìn)行 16S rDNA 測序共得 10 個菌門，12 個菌科，74 個菌屬。結(jié)果顯示，高銅組肉雞的盲腸內(nèi)微生物門水平以厚壁菌門、擬桿菌門為主；屬水平以另枝菌屬、瘤胃球菌屬 UCG-014、鏈球菌屬等為主,其中仍以另枝菌屬所占豐度最高，占 21%。據(jù)林奕岑等[26]報(bào)道肉雞盲腸中優(yōu)勢菌門為擬桿菌門(70%)，厚壁菌門(25.4%)，這與本試驗(yàn)中高銅結(jié)果相反：厚壁菌門占優(yōu)勢(75%)，擬桿菌門(22.67%)，而擬桿菌門下的另枝菌屬及厚壁菌門下的瘤胃球菌屬等作為肉雞盲腸的優(yōu)勢菌屬鮮少報(bào)道。這表明高銅的攝入可能導(dǎo)致盲腸菌群的紊亂。相關(guān)研究顯示，腸道菌群在營養(yǎng)吸收、免疫系統(tǒng)以及生殖功能等方面承擔(dān)相應(yīng)的作用。XU等[27]對結(jié)腸癌研究中提到，腸道微生物的組成變化會引起機(jī)體代謝狀態(tài)的變化。CLAVEL等[28]對腸道微生物代謝組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腸道菌群中益生菌優(yōu)勢時，腸道中丙酸和丁酸等菌群代謝物的濃度就會增加，這些代謝物會提升免疫細(xì)胞的活性。本試驗(yàn)利用 KEGG代謝通路分析顯示，與對照組相比高銅組肉雞腸道菌群在礦物質(zhì)吸收、D-丙氨酸代謝、苯丙氨酸代謝、蛋白激酶、細(xì)菌運(yùn)動性蛋白質(zhì)的代謝通路因子降低。這些通路因子改變，共同影響了肉雞對礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪的吸收和能量的轉(zhuǎn)化。這表明高銅的攝入影響菌群的同時也可能會改變其代謝通路及水平。

綜上所述，高銅日糧的攝入會導(dǎo)致銅滯留在肉雞盲腸內(nèi)，蓄積的銅會影響盲腸組織結(jié)構(gòu)，可能導(dǎo)致其營養(yǎng)吸收轉(zhuǎn)化效率降低。此外，銅的過度添加可能影響其內(nèi)部腸道菌群的組成以及代謝通路；因此建議按照《飼料添加劑安全使用規(guī)范》中推薦劑量(4～11 mg/kg)的最高劑量添加，基本不會影響肉雞盲腸組織結(jié)構(gòu)或菌群組成，也能其滿足生長需求。