何 羽 熊燦瓊

貴州省畢節(jié)市市場(chǎng)監(jiān)督管理局檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 畢節(jié) 551700

橢圓葉花錨為龍膽科植物橢圓葉花錨HaleniaellipticaD.Don的干燥全草。為我省少數(shù)民族用藥，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003 版)，貴州習(xí)稱黑耳草[1]、阿小根、龍膽、青魚膽、肝炎藥、黑節(jié)苦草、雞腳蓮、花錨、甲地然果、四棱草、小兒腫消、花臉錨等。據(jù)文獻(xiàn)記載[2-3]，我國(guó)花錨植物共2種1變種，即橢圓葉花錨HaleniaellipticaD.Don(包括原變種卵萼花錨H.ellipticavar.elliptica及變種大花花錨H.ellipticavar.grandiflora)和花錨H.corniculata(Linn)Comaz?；ㄥ^H.corniculata(Linn)Comaz主要分布于內(nèi)蒙東北部、華北地區(qū)[8]；橢圓葉花錨HaleniaellipticaD. Don主產(chǎn)于西藏、青海、云南、陜西、甘肅、四川、云南、貴州省等。根文獻(xiàn)報(bào)道[4-11]：橢圓葉花錨含有多種化學(xué)成分，主要有酮類、酮苷類、黃酮苷類、裂環(huán)烯醚萜類、三萜類以及甾體類成分。較多文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)其中的齊墩果酸進(jìn)行含量測(cè)定[5]，僅測(cè)定單一成分的含量，并不能有效的對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，因此，本文擬建立HPLC指紋圖譜，以便更加全面的評(píng)價(jià)黔產(chǎn)橢圓葉花錨的質(zhì)量。

2 方法與結(jié)果

2.1 材料

2.1.1 儀器與試藥 Waters e2695高效液相色譜儀；AY-120型電子分析天平(日本島津公司)；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；乙醇、磷酸為分析純，甲醇、乙腈為色譜純，試驗(yàn)用水為純化水；齊墩果酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院 批號(hào)：110709-201808)。

2.1.2 樣品信息 橢圓葉花錨采自貴州省各地區(qū)，經(jīng)貴州省藥品檢驗(yàn)所中藥學(xué)專家李楊老師鑒定為為龍膽科植物橢圓葉花錨HaleniaellipticaD. Don，樣品除去泥沙，曬干，粉碎，過四號(hào)篩，備用。 樣品詳情見表1。

表1 樣品信息

2.2 試驗(yàn)與結(jié)果

2.2.1 色譜條件 Camesil C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)；以25%甲醇為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0 mL；檢測(cè)波長(zhǎng)258 nm，柱溫：40 ℃。(見表2)

表2 流動(dòng)相梯度變化表

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取齊墩果酸對(duì)照品對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取橢圓葉花錨細(xì)粉1 g，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，稱定重量，水浴加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，用0.45 μm的微孔濾膜，即得。

2.2.4 精密度考察 取同一藥材粉末(S1)約1 g，按2.2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD(%)分別為1.05%與1.24%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性考察 取同一藥材粉末(S1)6份，每份約1 g，按2.2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD(%)分別為1.59%與1.38%(n=6)，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 取同一藥材粉末(S1)約1 g，按2.2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，于0、2、4、8、12、24、48 h分別依次進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD(%)分別為1.42%與1.61%，均小于2.0%，達(dá)到規(guī)定要求，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 特征峰的確定 根據(jù)12批黔產(chǎn)橢圓葉花錨藥材的HPLC圖譜的測(cè)定結(jié)果，共分離出23個(gè)色譜峰，將樣品的HPLC圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”進(jìn)行分析，多點(diǎn)校正，時(shí)間窗寬度為0.1，對(duì)照?qǐng)D譜生成為中位數(shù)，生成黔產(chǎn)橢圓葉花錨藥材HPLC對(duì)照指紋圖譜，共指認(rèn)了14個(gè)共有色譜峰。根據(jù)齊墩果酸對(duì)照品與樣品的HPLC色譜圖及對(duì)應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間及UV光譜圖進(jìn)行對(duì)比分析，確認(rèn)12號(hào)峰為齊墩果酸峰，且均達(dá)到了基線分離，峰信號(hào)較強(qiáng)。如圖1所示。

圖1 HPLC特征色譜圖

2.2.8 相似度計(jì)算及結(jié)果分析 將生成的對(duì)照?qǐng)D譜與12批樣品的HPLC色譜圖分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”進(jìn)樣分析，計(jì)算相似度，結(jié)果見表3。

表3 12批樣品的相似度結(jié)果

12批黔產(chǎn)橢圓葉花錨藥材的相似度均在0.90以上，說明各品種之間相似度較高，樣品質(zhì)量比較穩(wěn)定，所建立的HPLC指紋圖譜具有一定的代表性與實(shí)用性。

2.3 討論與小結(jié)

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用Waters PDA檢測(cè)器在200～400 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描，結(jié)果在258 nm的波長(zhǎng)處時(shí)，HPLC色譜圖信息量較大，峰形較好，對(duì)照品與相鄰雜質(zhì)峰之間均達(dá)到基線分離，空白溶液無干擾。

2.3.2 流動(dòng)相的選擇 分別考察了甲醇-水，甲醇-0.2%磷酸溶液，乙腈-水，乙腈-0.2%磷酸溶液，25%甲醇-乙腈等流動(dòng)相體系，經(jīng)反復(fù)優(yōu)化調(diào)整后梯度洗脫比例，結(jié)果25%甲醇-乙腈做流動(dòng)時(shí)相色譜圖分離效果最佳。

2.3.3 樣品溶液提取方法選擇 樣品分別采用不同濃度的甲醇和乙醇作溶劑水浴回流1～3 h不等，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲醇作溶劑時(shí)，雜質(zhì)峰干擾較小，水浴回流2 h，供試品成分提取較完全，色譜峰信息量較大，故選擇用甲醇作溶劑，水浴回流2 h進(jìn)行供試品溶液的制備。

2.3.4 相似度評(píng)價(jià) 建立HPLC指紋圖譜，并對(duì)12批樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果12批樣品的相似度均在0.90以上，采用龍膽科植物其他屬種的藥材進(jìn)行相互驗(yàn)證，結(jié)果相似度較低，表明該指紋圖譜能系統(tǒng)地闡明黔產(chǎn)橢圓葉花黔錨藥材內(nèi)在的品質(zhì)特征，以期能為該藥材的質(zhì)量控制提供參考。