李雨鑫，孔垂旭，鄒順惺，劉亞君

(云南大學(xué) 省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650032)

根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)是一類專性內(nèi)寄生于植物根系的生物[1]，其繁殖能力強(qiáng)，寄主廣泛，適應(yīng)力強(qiáng)，是危害農(nóng)作物的主要病原微生物之一。根結(jié)線蟲的防治方法主要有化學(xué)防治、物理防治、農(nóng)業(yè)防治、生物防治、抗病育種等[2-3]，其中，生物防治具有安全、環(huán)境兼容性好等特點(diǎn)，是綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要保障[4-7]。

厚垣普可尼亞菌(Pochoniachlamydosporia)是一種寄生真菌，屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)、絲孢綱(Hyphomycetes)、絲孢目(叢梗孢目)(Moniliales)、絲孢科(叢梗孢科)(Monilaceae)、普可尼亞屬(Pochonia)[8]，菌絲可侵入到根結(jié)線蟲卵或者死去雌蟲留下的包囊中進(jìn)行無性繁殖，產(chǎn)生分生孢子梗，從而導(dǎo)致根結(jié)線蟲死亡。厚垣普可尼亞菌可以產(chǎn)生一系列的酶類物質(zhì)[9]，其中絲氨酸蛋白酶VCP1是降解根結(jié)線蟲卵卵黃層的主要酶[10]，使幾丁質(zhì)層暴露[11]；胞外幾丁質(zhì)酶能夠分解根結(jié)線蟲卵卵殼的幾丁質(zhì)成分，從而導(dǎo)致根結(jié)線蟲死亡[12-13]。厚垣普可尼亞菌對(duì)根結(jié)線蟲具有很好的防治效果，是目前研究和開發(fā)生防菌劑的主要生防菌之一[14-16]。芽孢桿菌(Bacillussp.)是一類廣泛分布于植物根際的生防細(xì)菌，能產(chǎn)生抵抗逆境的芽孢，可在土壤中很好地定殖和繁殖[17-19]。芽孢桿菌分泌的堿性絲氨酸蛋白酶能夠分解根結(jié)線蟲的體壁，造成根結(jié)線蟲內(nèi)容物的泄露，最終殺死根結(jié)線蟲。此外，芽孢桿菌的穩(wěn)定性、與其它化學(xué)殺線蟲劑的相容性均優(yōu)于其它生防真菌和非芽孢類生防桿菌[20-22]。

由于土壤生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性，特別是土壤的抑菌作用，單一菌劑的施用防治效果往往不穩(wěn)定。前期研究發(fā)現(xiàn)，厚垣普可尼亞菌ZK7(簡(jiǎn)稱ZK7)與芽孢桿菌BacillusnematocidaB16(簡(jiǎn)稱B16)聯(lián)合使用能顯著提高ZK7對(duì)根結(jié)線蟲的防治效果；連續(xù)兩年的田間試驗(yàn)結(jié)果也表明，根部厚垣普可尼亞菌數(shù)量提高了10%～40%，防效提升了30%～50%，根結(jié)線蟲的抑制率提高了40%～60%[23]。在此基礎(chǔ)上，作者研究B16對(duì)ZK7產(chǎn)孢能力的影響，并初步鑒定相關(guān)信號(hào)物質(zhì)，為進(jìn)一步揭示細(xì)菌提高生防真菌防治根結(jié)線蟲能力的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

供試菌株：B16、ZK7，均由云南大學(xué)省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

南方根結(jié)線蟲卵塊，分離自溫室盆栽番茄根結(jié)。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，滅菌水1 L，pH值6.0～7.0，121 ℃滅菌20 min。

PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，滅菌水1 L，pH值6.0～7.0，121 ℃滅菌20 min。

NB培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，滅菌水1 L，pH值6.0～7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 菌株發(fā)酵液的制備

B16發(fā)酵液的制備：用接種環(huán)接一環(huán)B16菌株于裝有200 mL NB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于37 ℃、170 r·min-1搖床培養(yǎng)36 h；取發(fā)酵液測(cè)定600 nm處吸光度(OD600)，當(dāng)OD600值在1.8～2.0之間時(shí)，收集發(fā)酵液并分裝到50 mL滅菌離心管中，于4 ℃、8 500 r·min-1離心15 min；收集上清液，用0.22 μm細(xì)菌濾頭過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

ZK7發(fā)酵液的制備：用接種刀切取1 cm×1 cm的經(jīng)PDA平板活化后的ZK7菌塊于裝有250 mL PDB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于28 ℃、170 r·min-1搖床培養(yǎng)72 h，使其孢子數(shù)達(dá)到106個(gè)·mL-1；將ZK7發(fā)酵液用6層滅菌的擦鏡紙過濾，除去菌絲體，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)，調(diào)整孢子數(shù)為104個(gè)·mL-1，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 促產(chǎn)孢實(shí)驗(yàn)

將B16發(fā)酵液與ZK7發(fā)酵液分別按1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶10、1∶15、1∶20的比例混合，總體積40 mL；于28 ℃、170 r·min-1搖床共培養(yǎng)，每隔24 h用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)。將NB培養(yǎng)基和ZK7發(fā)酵液按上述比例混合作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，40 mL ZK7發(fā)酵液不做任何處理作為空白對(duì)照(CK)。處理組和對(duì)照組均做3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 促產(chǎn)孢揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)

(1)樣品的制備

B16培養(yǎng)液的制備：將B16菌株接種于裝有200 mL NB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于37 ℃、170 r·min-1搖床培養(yǎng)36 h,取5 mL培養(yǎng)液于15 mL頂空瓶中，加蓋密封。

ZK7培養(yǎng)液的制備：將ZK7菌株接種于裝有200 mL PDB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于28 ℃、170 r·min-1搖床培養(yǎng)36 h，取5 mL培養(yǎng)液于15 mL頂空瓶中，加蓋密封。

共培養(yǎng)液的制備：將B16發(fā)酵液與ZK7發(fā)酵液按1∶7混合，于28 ℃、170 r·min-1搖床共培養(yǎng)36 h，取5 mL培養(yǎng)液于15 mL頂空瓶中，加蓋密封。

(2)固相微萃取

將SAAB-57318型75 μm CAR/PDMS 固相微萃取儀的萃取頭暴露于培養(yǎng)液上方約1.5 cm處；中速(攪拌時(shí)萃取頭不接觸到樣品)攪拌，65 ℃加熱，吸附萃取1 h；萃取結(jié)束后迅速將萃取頭縮回并拔出針頭，立即插入到氣相色譜氣化室的進(jìn)樣口中，輕輕向下推出萃取頭，利用氣化室的高溫條件讓待測(cè)物解析1 min。

分析條件：Agilent 7890GC/5975MSD型氣質(zhì)聯(lián)用儀，HP-5MS型色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，填料為5%苯基-95%甲基聚硅氧烷；載氣為氦氣(He)，流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱溫：起始溫度50 ℃，保持2 min，以6 ℃·min-1升溫至180 ℃，再以8 ℃·min-1升溫至240 ℃，保持10 min；分流進(jìn)樣，分流比10∶1；總運(yùn)行時(shí)間40 min；質(zhì)譜掃描范圍35～550 amu；離子源為EI源；電子能量70 eV。

1.5 促產(chǎn)孢揮發(fā)性物質(zhì)的驗(yàn)證

B16與ZK7共培養(yǎng)后產(chǎn)生了新的揮發(fā)性物質(zhì)。選取2種含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)丁內(nèi)酯、甲苯進(jìn)行純品驗(yàn)證，以進(jìn)一步驗(yàn)證這些揮發(fā)性物質(zhì)是否與ZK7產(chǎn)孢量的增加有關(guān)。

將10 mL ZK7發(fā)酵液加入到裝有150 mL PDB培養(yǎng)基的300 mL三角燒瓶中，然后加入丁內(nèi)酯/甲苯，使其濃度(以10 mL ZK7發(fā)酵液計(jì)，mg·mL-1)分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，以不加丁內(nèi)酯/甲苯為空白對(duì)照，在28 ℃、170 r·min-1條件下分別搖床培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)各處理組的孢子數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 B16對(duì)ZK7產(chǎn)孢量的影響(圖1)

注：C表示實(shí)驗(yàn)對(duì)照，CK表示空白對(duì)照；對(duì)72 h數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析以及圖基多重比較，*表示P<0.05,**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001，下圖同。

從圖1可以看出，B16發(fā)酵液與ZK7發(fā)酵液按1∶5、1∶7、1∶10比例混合時(shí)，B16對(duì)ZK7的產(chǎn)孢有一定促進(jìn)作用，其中按1∶7比例混合共培養(yǎng)時(shí)對(duì)ZK7產(chǎn)孢量的影響最顯著。與空白對(duì)照相比，ZK7的產(chǎn)孢量最高提高了318.31%；在扣除NB培養(yǎng)基的影響后，產(chǎn)孢量最高提高了183.17%。

2.2 促產(chǎn)孢揮發(fā)性物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果(表1)

從表1可以看出，B16單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)包括hexanal、2,5-dimethyl-pyrazine、2-heptanone、benzaldehyde、benzeneacetaldehyde、3-eicosene、(E)-benzeneacetaldehyde、2-nonanone、decanal、dodecanal、(Z)-9,17-octadecadienal、fluorene、(Z,Z)-9,12-octadecadienoic acid、2-hydroxy-cyclopentadecanone、heptadecane、dibutyl phthalate；ZK7單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)包括acetic acid、hexanal、2-amino-6-methylbenzoic acid、benzaldehyde、1,3-dimethoxy-benzene、(Z)-9,17-octadecadienal；B16與ZK7共培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的新?lián)]發(fā)性物質(zhì)包括pentane、piperazine、3-aminopyrrolidine、trichloromethane、(E)-2-pentenal、3-hydroxy-2-butanone、toluene、butyrolactone、1-ethynyl-4-methyl-benzene、1-methyl-4-piperidinemethanol、benzocycloheptatriene、2-octyl-cyclopropaneoctanal。

表1 B16、ZK7單獨(dú)培養(yǎng)及共培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)

2.3 促產(chǎn)孢揮發(fā)性物質(zhì)的驗(yàn)證結(jié)果(圖2)

從圖2a可以看出，加入不同濃度的丁內(nèi)酯，ZK7的產(chǎn)孢量均比空白對(duì)照高；并且隨著丁內(nèi)酯濃度的增加，ZK7的產(chǎn)孢量逐漸升高，當(dāng)加入1.0 mg·mL-1丁內(nèi)酯培養(yǎng)72 h時(shí)，ZK7的產(chǎn)孢量提高了262.00%。表明丁內(nèi)酯能促進(jìn)ZK7產(chǎn)孢。

從圖2b可以看出，加入不同濃度的甲苯，ZK7的產(chǎn)孢量均比空白對(duì)照低；并且隨著甲苯濃度的增加，ZK7的產(chǎn)孢量不斷降低，當(dāng)加入1.0 mg·mL-1甲苯培養(yǎng)72 h時(shí)，ZK7的產(chǎn)孢量降低了74.62%。這說明甲苯不能促進(jìn)ZK7產(chǎn)孢，而且過多的甲苯對(duì)ZK7產(chǎn)孢具有抑制作用。

圖2 丁內(nèi)酯(a)和甲苯(b)對(duì)ZK7產(chǎn)孢量的影響

2.4 討論

Kerry[24]認(rèn)為衡量一株生防真菌生防潛質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)包括：菌株的產(chǎn)孢能力、對(duì)根結(jié)線蟲卵的侵染能力以及菌株的定殖能力(包括根際土壤及植物根內(nèi)的定殖量)。從B16對(duì)ZK7的關(guān)鍵生防因子的測(cè)試可知，B16能促進(jìn)ZK7分生孢子的產(chǎn)生。產(chǎn)孢能力的提高，有利于ZK7在土壤中能更好地定殖，從而增加ZK7侵染根結(jié)線蟲卵幾率，提高ZK7對(duì)根結(jié)線蟲的生物防治效果。厚垣普可尼亞菌的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于分生孢子能抵御外界環(huán)境的不良影響，具有繁殖能力，芽孢桿菌可以促進(jìn)厚垣普可尼亞菌產(chǎn)孢，提高分生孢子的產(chǎn)量，促產(chǎn)孢應(yīng)該只是芽孢桿菌提高厚垣普可尼亞菌防治效率的因素之一。

與單獨(dú)培養(yǎng)相比，混合共培養(yǎng)時(shí)，B16發(fā)酵液與ZK7發(fā)酵液的最佳比例為1∶7，排除培養(yǎng)基的影響后，能使ZK7的產(chǎn)孢量最高提高183.17%。B16與ZK7共培養(yǎng)后產(chǎn)生了新的揮發(fā)性物質(zhì)，其中丁內(nèi)酯被證明與曲霉分生孢子的產(chǎn)生有關(guān)。Schimmel等[25]研究了丁內(nèi)酯對(duì)曲霉分生孢子的影響，發(fā)現(xiàn)500 μmol·L-1的丁內(nèi)酯能使曲霉的產(chǎn)孢量提高3倍。本研究結(jié)果表明，丁內(nèi)酯對(duì)ZK7的產(chǎn)孢能力具有促進(jìn)作用，產(chǎn)孢量隨著丁內(nèi)酯濃度的增加逐漸升高，而甲苯對(duì)ZK7的產(chǎn)孢能力沒有促進(jìn)作用。

3 結(jié)論

研究了芽孢桿菌B16對(duì)根結(jié)線蟲生防真菌厚垣普可尼亞菌ZK7產(chǎn)孢能力的影響，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌B16能顯著提高厚垣普可尼亞菌ZK7的產(chǎn)孢量；芽孢桿菌B16發(fā)酵液與厚垣普可尼亞菌ZK7發(fā)酵液共培養(yǎng)產(chǎn)生的丁內(nèi)酯能促進(jìn)ZK7產(chǎn)孢，產(chǎn)生的甲苯對(duì)厚垣普可尼亞菌ZK7的產(chǎn)孢能力沒有促進(jìn)作用。芽孢桿菌B16與厚垣普可尼亞菌ZK7聯(lián)合進(jìn)行生物防治可應(yīng)對(duì)土壤環(huán)境的多樣性，其防治效果比單一菌劑有所提高。