錢薇 褚明亮

癌癥為世界第二大死亡原因，其死亡率和發(fā)病率逐年攀升。臨床治療癌癥大多以手術(shù)治療和放化療為主，其預(yù)后大多較差，存在生存率低、復(fù)發(fā)率高、多并發(fā)癥等一系列問(wèn)題[1-2]。紫草是紫草科紫草屬植物，其功效為涼血活血、解毒透疹[3-4]?，F(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為痰濁較盛、結(jié)聚成塊為腫瘤的病因所在，紫草可涼血活血使熱毒癰瘍散去以達(dá)到其療效。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)紫草可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞程序性凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞通路活性、誘導(dǎo)ROS、抑制血管生成等方面抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖[5]。但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及機(jī)制少有報(bào)道。因此該研究將在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的基礎(chǔ)上分析紫草的抗癌作用機(jī)制，為其運(yùn)用于臨床提供更多的研究思路。

1 材料與方法

1.1 軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)

UniProt數(shù)據(jù) 庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）， 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php），DrugBank數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//www.drugbank.ca/），Cyto-scape 3.7.1 軟 件（https：//cytoscape.org/），GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/），String數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//stringdb.org/），Metascape數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）。

1.2 紫草活性成分和靶點(diǎn)篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中收集紫草的化學(xué)成分，時(shí)間截至2021年1月。并以類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18、口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%為條件篩選紫草的有效活性化合物，利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)除去非人源基因，把相應(yīng)靶點(diǎn)蛋白名稱轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)的Uniprot ID。

1.3 紫草活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集“1.2”項(xiàng)下紫草中的活性成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，利用Cyto-scape 3.7.1軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 癌癥靶點(diǎn)信息的篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入“cancer”為疾病名稱，使Relevance score≥12.43進(jìn)行篩選，得到GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)癌癥相關(guān)靶點(diǎn)信息；并把“cancer”疾病關(guān)鍵詞輸入DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索，得到DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)癌癥相關(guān)靶點(diǎn)信息。將以上兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選后獲得的靶點(diǎn)信息進(jìn)行合并。把Uniprot ID不具有的靶點(diǎn)去除，把相同Uniprot ID的不同靶點(diǎn)刪除，保留Uniprot ID的唯一靶點(diǎn)。利用在線韋恩將紫草的主要活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與癌癥相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行交集分析并繪制韋恩圖，提取紫草和癌癥疾病的交集靶點(diǎn)。

1.5 癌癥與紫草對(duì)共同靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction network，PPI）關(guān)系

將癌癥與紫草素的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)，選取>0.700作為蛋白之間相互作用的信度依據(jù)，隱藏散在的節(jié)點(diǎn)，最終得到癌癥與紫草對(duì)共同靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作PPI圖。將篩選得到的互作靶點(diǎn)輸入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，在數(shù)據(jù)庫(kù)中完成KEGG通路富集。

1.6 紫草抗癌活性成分-靶點(diǎn)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

利用Cyto-scape 3.7.1軟件，在“1.3”項(xiàng)紫草活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上連接各基因信號(hào)通路，構(gòu)建“紫草抗癌活性成分-靶點(diǎn)-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 紫草活性成分、靶點(diǎn)篩選及網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集到紫草中包含51個(gè)活性成分，經(jīng)過(guò)篩選得到10個(gè)主要活性成分，見(jiàn)表1。對(duì)10個(gè)活性成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行收集，共獲得83個(gè)藥物相關(guān)靶點(diǎn)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)檢索83個(gè)靶點(diǎn)蛋白的對(duì)應(yīng)基因名并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化檢索，去除暫無(wú)對(duì)應(yīng)基因名稱的蛋白和10個(gè)主要活性成分重復(fù)的蛋白，最后共獲得69個(gè)藥物靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)基因，見(jiàn)圖1。

圖1 紫草活性成分-靶點(diǎn)圖

表1 紫草的10個(gè)活性化合物及其參數(shù)信息

2.2 紫草藥物靶點(diǎn)-癌癥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲得25 466個(gè)與癌癥相關(guān)的基因和靶點(diǎn)信息，經(jīng)Relevance score≥12.43篩選后獲得1 597個(gè)與癌癥相關(guān)的基因和靶點(diǎn)信息。后在DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收集了125個(gè)與癌癥相關(guān)的基因和靶點(diǎn)信息。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因合并后除去46個(gè)重復(fù)基因，共獲得1 672個(gè)與癌癥相關(guān)的基因和靶點(diǎn)信息。運(yùn)用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)83個(gè)紫草藥物靶點(diǎn)蛋白和1 672個(gè)癌癥相關(guān)所得蛋白靶點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，通過(guò)在線韋恩獲得紫草藥物靶點(diǎn)與癌癥疾病靶點(diǎn)共有靶點(diǎn)15個(gè)（見(jiàn)圖2小橢圓形節(jié)點(diǎn)）。

利用Cyto-scape 3.7.1軟件構(gòu)建紫草活性成分靶點(diǎn)和癌癥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)圖，見(jiàn)圖2。顯示共22個(gè)節(jié)點(diǎn)和44條邊。其中八邊形節(jié)點(diǎn)（ZC）代表紫草，大橢圓形節(jié)點(diǎn)（cancer）代表癌癥疾病，5個(gè)三角形節(jié)點(diǎn)代表有效活性成分，小橢圓形節(jié)點(diǎn)代表15個(gè)目標(biāo)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，黑色的線條代表有效活性成分與目標(biāo)靶點(diǎn)之間相互作用關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)的度值表現(xiàn)其與其他節(jié)點(diǎn)的相連性，節(jié)點(diǎn)的度值于節(jié)點(diǎn)的關(guān)鍵性呈正比。其中1-甲氧基乙酰紫草素（MOL007714）的度值（degree）最高，為10。

圖2 紫草活性成分靶點(diǎn)和癌癥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)據(jù)圖

2.3 癌癥疾病與紫草對(duì)共同靶點(diǎn)的PPI分析

將15個(gè)癌癥-藥物共同靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，并設(shè)置高等置信度蛋白參數(shù)評(píng)分值>0.700，獲取相應(yīng)蛋白互相作用信息。網(wǎng)絡(luò)中共包含15個(gè)節(jié)點(diǎn)，40條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值5.33。將網(wǎng)絡(luò)信息TSV數(shù)據(jù)格式導(dǎo)入Cyto-scape 3.7.1軟件構(gòu)建各蛋白互相作用的PPI網(wǎng)絡(luò)后，進(jìn)行拓?fù)浞治觯渲蠩SR1、AR、PGR等基因的節(jié)點(diǎn)度值>8，明顯高于其他靶點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

圖3 紫草治療癌癥疾病靶點(diǎn)蛋白互作PPI圖

2.4 紫草治療癌癥疾病互作靶點(diǎn)KEGG通路分析

通過(guò)KEGG通路分析，共獲得10條信號(hào)通路，見(jiàn)表2。使用Cyto-scape 3.7.1軟件，在“2.3”項(xiàng)紫草活性成分靶點(diǎn)和癌癥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）基礎(chǔ)上連接各基因信號(hào)通路，構(gòu)建出“紫草抗癌活性成分-靶點(diǎn)-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。從網(wǎng)絡(luò)圖中可以發(fā)現(xiàn)紫草的5個(gè)活性成分與12個(gè)靶點(diǎn)及10條通路之間有密切的相互關(guān)聯(lián)作用。篩選出其中靶點(diǎn)數(shù)較多的兩條通路，分別為癌癥通路（pathways in cancer）和雌激素信號(hào)通路（estrogen signaling pathway）。

圖4 “活性成分-靶點(diǎn)-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)圖

表2 紫草治療靶點(diǎn)相關(guān)通路信息

3 討論

研究先通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘，篩選得到紫草的10個(gè)有效活性成分，其中1-甲氧基乙酰紫草素、吡氟甲禾靈、甘露醇、谷甾醇和乙酰紫草素5種活性成分與癌癥疾病關(guān)聯(lián)度較高。特別是1-甲氧基乙酰紫草素和乙酰紫草素，兩者均為萘醌類化合物，具有抗腫瘤等多種藥理作用[5-9]。

PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)表明，AR、ESR1、PGR等基因的節(jié)點(diǎn)度值>8，明顯高于其他靶點(diǎn)（圖3），說(shuō)明紫草抗癌的核心潛在靶點(diǎn)可能為上述靶點(diǎn)。AR是典型的雄激素受體，參與乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展，并與其預(yù)后及相關(guān)治療密切相關(guān)[10-13]。ESR1基因是ER家族中ERα類基因，雌激素通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)的ER受體結(jié)合發(fā)揮其各種功能。研究表明紫草就可以通過(guò)ESR1抑制雌激素信號(hào)通路中的ER受體表達(dá)，抑制子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的增殖[14]。PGR，也稱為PR，為孕酮受體。PR和ER常常聯(lián)合出現(xiàn)在乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌等相關(guān)腫瘤疾病中，并共同作用調(diào)控腫瘤細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等[15-19]。

進(jìn)一步的KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，紫草治療癌癥疾病是通過(guò)10條信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的（表2和圖4）。而其中的癌癥通路和雌激素信號(hào)通路與相關(guān)靶點(diǎn)的關(guān)系最為密切，分別為6個(gè)和5個(gè)（表2和圖4），由此可推測(cè)紫草可能主要通過(guò)以上2條通路發(fā)揮抑制腫瘤作用的。

總之，該研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)紫草進(jìn)行了多成分、多靶點(diǎn)、多通路的探究。研究結(jié)果初步指明了紫草中的有效活性成分及重要靶點(diǎn)通路，為進(jìn)一步的探究提供了良好的基礎(chǔ)。