師子豪，祝偉霞＊，魏 蔚，楊冀州，趙運(yùn)勝

（鄭州海關(guān)技術(shù)中心，鄭州 450003）

三文魚(yú)屬于冷水性高度洄游魚(yú)類，是鮭科魚(yú)類或鮭鱒魚(yú)類的商品名稱，是世界名貴魚(yú)類之一。三文魚(yú)鱗小刺少，肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，在眾多的海產(chǎn)品中，以其獨(dú)特的口味、豐富的營(yíng)養(yǎng)，受到越來(lái)越多人的青睞。氨基酸是三文魚(yú)體內(nèi)蛋白質(zhì)的基本分子，參與機(jī)體維持、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、生物代謝等重要生命活動(dòng)。近年來(lái)，在食品科學(xué)、環(huán)境工程、生物化學(xué)等領(lǐng)域有關(guān)氨基酸的分析已成為熱點(diǎn)問(wèn)題[1]。我國(guó)是三文魚(yú)的主要進(jìn)口國(guó)家，為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)三文魚(yú)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，保障進(jìn)口食品的質(zhì)量安全，建立三文魚(yú)中氨基酸含量的分析方法是非常重要的。

目前，氨基酸檢測(cè)的研究報(bào)道主要采用氨基酸分析儀[2]、液相色譜法[3]、離子色譜法[4]、氣相色譜-氫火焰離子化法（GC-FID）[5]、氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）[6]、液相色譜質(zhì)譜（LC-MS）[7]、氣相色譜-同位素比值質(zhì)譜（GC-IRMS）[8][9]等技術(shù)。為將氨基酸結(jié)構(gòu)中羧基和氨基極性基團(tuán)生成相應(yīng)的揮發(fā)物，本文聯(lián)合采用分步衍生化進(jìn)行操作，首先在酸化甲醇進(jìn)行醇基甲酯化，再在堿性乙酸酐溶劑中進(jìn)行氨基乙?；苌磻?yīng)，衍生物經(jīng)GC-FID進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果經(jīng)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.124-2016[10]進(jìn)行比較，證明本方法結(jié)果準(zhǔn)確，可用三文魚(yú)中氨基酸的含量測(cè)定。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GC2030型氣相色譜儀-氫火焰離子化檢測(cè)器（日本島津公司）；T18型渦旋混勻器（德國(guó)IKA公司）；OA-SYS氮?dú)鉂饪s儀（美國(guó)Organomation公司）；16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥95%，均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乙酸酐（色譜純，天津富宇試劑）；甲醇、乙酸乙酯（色譜純，德國(guó)默克公司）；乙酰氯（色譜純，上海阿拉丁公司），其它均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：稱取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)250mg于25mL容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為10mg/mL的單個(gè)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確量取2mL的單標(biāo)溶液用0.1mol/L鹽酸溶液稀釋并定容50mL，配制得到質(zhì)量濃度為400mg/L的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 試驗(yàn)方法

稱取10mg干基樣品，加入2mL6mol/L鹽酸溶液，渦旋混勻3min，氮?dú)庵脫Q上層空氣，110℃烘箱24 h水解，取出后降至室溫，加入正己烷-二氯甲烷（6:5）液液分配除脂，并于70℃氮?dú)饬飨麓蹈伞＜尤爰状?乙酰氯（6:1,V/V）0.7mL，渦旋混勻1min，70℃反應(yīng)1h，取出后冷卻至室溫，氮?dú)獯蹈伞Ｔ偌尤胍阴；噭┮宜狒?三乙胺-丙酮（1:2:5,V/V/V）于70℃反應(yīng)10min后，氮?dú)獯蹈?。加?mL乙酸乙酯溶解殘?jiān)?mL飽和氯化鈉液液分配，于4000r/min離心后取上層有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉除水，經(jīng)0.22 有機(jī)相膜過(guò)濾，供GC-FID檢測(cè)。

1.3 儀器工作條件

美國(guó)安捷倫VF-35ms色譜柱（30m×0.32mm，1.0μm）；進(jìn)樣口溫度為300℃，檢測(cè)器溫度為305℃；氫氣流量和空氣流量分別為32mL/min和350mL/min；載氣為氦氣，載氣流量為5.06mL/min；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量為1μL。色譜柱升溫程序：80℃保持1min，再以20℃/min的速率升至135℃，再以3℃/min的速率升至180℃，再 以5℃/min的 速 率 升 至220℃，再 以15℃/min的速率升至305℃并保持10min，總運(yùn)行時(shí)間為42.42min。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲基化反應(yīng)條件的優(yōu)化

氨基酸結(jié)構(gòu)中含有氨基和羧基極性結(jié)構(gòu)，進(jìn)行測(cè)定時(shí)需采用相應(yīng)的衍生化技術(shù)，生成適合氣相色譜分析的揮發(fā)性物。因?yàn)榘被岱肿又械聂然c其它有機(jī)酸的羧基一樣，在酸性條件下可以與小分子醇反應(yīng)生成相應(yīng)的酯類物質(zhì)。本文首先比較了甲醇、乙醇、異丙醇進(jìn)行甲酯化的效果，結(jié)果證明采用甲醇反應(yīng)產(chǎn)率高。通過(guò)對(duì)不同比例甲醇-乙酰氯（1:3、1:6、1:9，V/V）溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，數(shù)據(jù)表明甲醇-乙酰氯（1:6，V/V）時(shí)，色氨酸響應(yīng)最高（如圖1所示），其它19種氨基酸甲酯化產(chǎn)物≥92%。本方法最終采用甲醇-乙酰氯（1:6，V/V）進(jìn)行甲酯化。

圖1 甲醇-乙酰氯衍生化條件下，色氨酸色譜峰的響應(yīng)。（A為1:3，B為1:6，C為1:9）

2.2 乙酰化反應(yīng)條件的優(yōu)化

反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間作為乙?；苌闹匾蛩?，本文對(duì)比了在10min～120min時(shí)間和在20℃～100℃溫度之間的區(qū)別。結(jié)果表明70℃水浴反應(yīng)10min乙?；首罡摺D2列出16種氨基GC-FID色譜圖。

圖216 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液GC-FID色譜圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及回收試驗(yàn)

取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按照本方法所述操作進(jìn)行衍生化，分別在200mg/L，100mg/L，50mg/L，20mg/L，10mg/L，5mg/L濃度水平進(jìn)行測(cè)定，線性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。在三文魚(yú)樣品中添加質(zhì)量濃度50mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測(cè)得回收率見(jiàn)表1。

表1 回歸方程線性、R2值、三文魚(yú)樣品中添加濃度及其回收率

續(xù)表

3 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法測(cè)定三文魚(yú)樣品，測(cè)定樣品圖譜見(jiàn)圖3，測(cè)定結(jié)果經(jīng)與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.124-2016比較，兩種方法測(cè)定結(jié)果一致，結(jié)果偏差小于10%，本方法可用于三文魚(yú)中氨基酸含量的測(cè)定。

圖3 挪威三文魚(yú)樣品中16種氨基酸GC-FID色譜圖