王 艷 鄧衛(wèi)平 李瑞明

1.中山市博愛醫(yī)院消化內(nèi)科 (廣東 中山， 8306123) 2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院消化內(nèi)科

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是我國最常見的慢性肝病，而肝纖維化的發(fā)展和進展是NAFLD患者預(yù)后最重要的預(yù)測因素[1]。因此，早期識別肝纖維化變得越來越重要。目前關(guān)于NAFLD生物標記物的研究主要集中于以下三類：①診斷標記物，用于反映目前的纖維化階段；②預(yù)后標記物，根據(jù)纖維化進展風(fēng)險對個體進行分層，并用于預(yù)測患者預(yù)后；③監(jiān)測標記物，可用于跟蹤疾病進展或治療反應(yīng)。但是目前臨床上常用的血清學(xué)標志物，例如肝功能指標、肝纖維化指標等[2]，都具有一定的滯后性和非特異性，這些指標的波動可能受到共病條件的影響，因此需要對結(jié)果進行嚴格的解釋。越來越多的證據(jù)表明，長鏈非編碼RNA(LncRNA)作為一種相對穩(wěn)定的遺傳標記，在肝纖維化鑒別診斷中發(fā)揮著作用要作用[3]。尤其是血漿外泌體中的LncRNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，適用于常規(guī)檢測。但是目前外泌體LncRNA檢測仍然處于實驗性階段，需要大量臨床樣本進一步驗證。近幾年，越來越多的基礎(chǔ)研究證實，核富集轉(zhuǎn)錄體1(NEAT1)是肝纖維化過程中的關(guān)鍵分子[4]。然而少有臨床研究的證據(jù)支持。因此本研究通過對183例在我院就診的非酒精性脂肪肝炎(NASH)患者的血液樣本進行實時熒光定量PCR法檢測，分析不同臨床特征的患者之間血清外泌體LncRAN NEAT1水平的差異，以及該指標在肝纖維化監(jiān)測中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2015年1月～2018年12月期間就診的183例NASH患者的病歷資料和血液樣本，包括90例未發(fā)生纖維化患者(男性55例，女性35例)，年齡21～76歲，平均(43.66±14.19)歲和93例纖維化患者(男性58例，女性35例)，年齡19～78歲，平均(44.97±12.60)歲。所有的研究參與者都接受了病史、體格檢查、人體測量和實驗室檢查。另外選擇50例和NASH患者性別、年齡相匹配的健康志愿者作為正常對照組(男性32例，女性18例，年齡20～73歲，平均年齡45.48±13.50歲)。正常對照組人群肝功能檢測、肝臟超聲檢查結(jié)果均正常。本研究經(jīng)由我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核備案，且完全符合赫爾新基宣言。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①根據(jù)飲酒史、臨床表現(xiàn)、實驗室檢測、典型的影像學(xué)(US、CT、MRI)檢查確診為NASH，符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南》[5]中關(guān)于NASH的診斷標準；②在超聲引導(dǎo)下經(jīng)肝組織穿刺活檢判斷患者是否發(fā)生肝纖維化。排除標準：①排除晚期肝硬化者(Child-Turcotte-Pugh B或C級)、病毒性或自身免疫性肝炎性疾病、大量飲酒史(女性>20 g/d，男性>30 g/d)、使用脂肪性藥物或與肝臟脂肪堆積有關(guān)的遺傳性疾?。虎谟懈我浦彩中g(shù)史、腎功能受損、缺血性心臟或腦血管疾病或惡性腫瘤患者。

1.3 研究方法

1.3.1 檢測指標 ①體重指數(shù)(BMI)、全血計數(shù)[淋巴細胞百分比(LYM%)、中性粒細胞百分比(NEU%)、血紅蛋白(Hb)和血小板(PLT)，計算中性粒細胞/淋巴細胞比值(NLR)及血小板/淋巴細胞比值(PLR)、肝功能指標[包括血清總膽紅素(TBil)、血清白蛋白(Alb)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、血清總蛋白(TP)、空腹血糖(FBG)、血脂代謝指標[高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、血清總膽固醇(TC)。②采用穩(wěn)態(tài)模式評估法(HOMA-IR)評估胰島素抵抗指數(shù)(IR)= FBG×FINS/22.5。所有的生化指標在采集血樣后2 h內(nèi)檢測完畢,并在多道自動分析儀(日本Hitachi公司)上測量。③通過酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清細胞角蛋白18(CK-18)。④采用放射免疫法試劑盒檢測血清肝纖維化指標[Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、層粘連蛋白(LN)、透明質(zhì)酸(HA)]。⑤根據(jù)活檢組織(至少需要15 mm長的活檢標本或至少10個完整的門靜脈束的存在)中含有脂滴的肝細胞百分比(≥5%)評估脂肪變性，采用歐洲脂肪肝協(xié)作組提出的肝組織脂肪變性、炎癥活動度及纖維化(SAF)評分標準進行評估[6]：F1，竇周或門靜脈周圍纖維化；F2，無橋接的竇周和門靜脈周圍纖維化；F3，橋接纖維化；F4，肝硬化。F1～F2期為輕中度期，F(xiàn)3～F4期為進展期。

1.3.2 提取血清外泌體并采用qRT-PCR法檢測LncRNA NEAT1相對表達量 取500 μl血清加入126 μl外泌體快速沉淀液(美國System Biosciences公司)，4℃條件下放置30 min，3 000 r/min離心30 min，棄上清，留取沉淀，得到外泌體。外泌體樣本鑒定：采用免疫印跡(Western Blot)法檢測外泌體標志性蛋白CD9、CD63、TSG101的陽性表達情況以及Calnexin蛋白的陰性表達情況。透射電鏡下觀察外泌體形態(tài)特征，采用NanoSight LM10顆粒跟蹤系統(tǒng)(美國Malvern公司)對外泌體粒徑進行分析和校準。

1.3.3 qRT-PCR法檢測外泌體LncRNA NEAT1相對表達量利用Trizol試劑(美國invitrogen公司)從外泌體樣本中提取總RNA。取0.5～1 μg的RNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板，采用RNAspin Mini Isolation Kit(美國Applied Biosystem公司)采用隨機引物進行RT反應(yīng)。采用NCBI BLAST設(shè)計NEAT1引物：正向5′-GGC AGG TCT AGT TTG GGC AT-3′，反向5′-CCT CAT CCC TCC CAG TAC C-3′。用SYBR Green Mix試劑盒(GoTaq?qPCR Master Mix；美國Promega公司)配制25 μl PCR反應(yīng)體系。采用One-step 實時PCR系統(tǒng)(美國Applied biosystem系統(tǒng))在48孔板上進行qRT-PCR。參數(shù)設(shè)置：第一步1個循環(huán)，95℃ 2 min；第二步40個循環(huán)，95℃ 15 s，58℃ 40 s；第三步，95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s收集熒光信號。對每個樣本單獨重復(fù)3次實驗。選擇β-actin作為內(nèi)參：正向5’-ATC AAG ATT CTC TCT CTC TGA-3’；反向5’-CTG CTT GCT GAT CCC TCC TCC TG-3’。通過計算公式(2-ΔΔCt)得到NEAT1表達的相對倍數(shù)變化。

2 結(jié)果

2.1 基線資料 見表1。與正常對照組相比，肝纖維化組和非肝纖維化組NASH患者BMI、PLT、糖尿病史比例、ALT、AST、GGT、FBG、HOMA-IR、TG、LDL-C、CK-18、PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平升高，同時PLT、ALB水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而且與非肝纖維化組患者人群相比，肝纖維化組患者GGT、CK-18、PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平進一步升高，同時PLT水平亦進一步降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 基線資料在各組人群的組間對比

2.2 血清外泌體的提取和鑒定 經(jīng)試劑盒提取得到外泌體樣本后，采用透射電鏡和Western Blot法鑒定，外泌體呈典型的圓形或杯狀形態(tài)，直徑約50～150 nm，肝纖維化組和非肝纖維化組NASH患者血清外泌體粒徑略大于正常對照組人群[(118.5±3.7)nm vs(100.2±2.6)nm vs(65.0±2.3)nm]。經(jīng)Western Blot條帶圖顯示，外泌體標記物包括蛋白CD63和TSG101在呈高表達。以calnexin蛋白作為陰性對照，已證實外泌體中無此蛋白，但上清樣本中有此蛋白(見圖1)。

圖1 透射電鏡、納米顆粒示蹤分析、western blot法鑒別外泌體形態(tài)、粒徑大小和特征蛋白表達

2.3 血清外泌體LncRNA NEAT1相對表達量 經(jīng)qRT-PCR法檢測，肝纖維化組、非肝纖維化組、正常對照組人群血清外泌體LncRNA NEAT1相對表達量分別為(1.99±0.78)、(1.23±0.34)、(1.00±0.22)，與正常對照組人群相比，肝纖維化組和非肝纖維化組NASH患者血清外泌體LncRNA NEAT1相對表達量均升高，肝纖維化組患者升高趨勢更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 血清外泌體LncRNA NEAT1與NASH患者肝纖維化的關(guān)系 根據(jù)肝纖維化組患者血清外泌體LncRNA NEAT1相對表達量的中位值和四分位值，劃分為4個區(qū)間：<1.35，1.35～1.77，1.78～2.58，>2.58。采用多元線性回歸模型，校正各種混雜因素后，血清外泌體LncRNA NEAT1>1.77是NASH患者發(fā)生肝纖維化的重要獨立危險因素之一(P<0.05)(表2)。

表2 血清外泌體LncRNA NEAT1與肝纖維化的多元線性關(guān)系

2.5 肝纖維化組患者血清外泌體LncRNA NEAT1與AST/ALT、GGT/PLT、PLR、NLR的關(guān)系 經(jīng)Pearson法分析，肝纖維化組患者血清外泌體LncRNA NEAT1相對表達量與GGT/PLT、NLR呈正相關(guān)性，r=0.226,0.320，P<0.05；但是與AST/ALT和PLR未見明顯關(guān)系，r=0.132,-0.035，P=0.207,0.738(見圖2)。

圖2 肝纖維化組患者血清外泌體LncRNA NEAT1與AST/ALT、GGT/PLT、PLR、NLR的相關(guān)性

2.6 肝纖維化組患者血清外泌體LncRNA NEAT1與肝纖維化病情進展的關(guān)系 根據(jù)SAF評分，67例患者為F1～F2期輕中度肝纖維化，26例患者為F3～F4進展期肝纖維化，兩個亞組患者血清外泌體LncRNA NEAT1相對表達量分別為(1.70±0.55)和(2.76±0.77)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，輕中度肝纖維化患者血清外泌體LncRNA NEAT1相對表達量低于進展期肝纖維化患者。

2.7 血清外泌體LncRNA NEAT1對NASH患者發(fā)生肝纖維化以及進展期肝纖維化的診斷價值 經(jīng)ROC曲線分析，血清外泌體LncRNA NEAT1對于肝纖維化診斷的靈敏度和特異度分別為67.71%和99.96%，曲線下面積為0.889(95%CI：0.884～0.934)(見圖3A)。而血清外泌體LncRNA NEAT1對于進展期肝纖維化診斷的靈敏度和特異度分別為76.98%和80.65%，曲線下面積為0.865(95%CI：0.783～0.948)(見圖3B)。

圖3 血清外泌體LncRNA NEAT1診斷NASH患者出現(xiàn)肝纖維化(A)以及進展期肝硬化(B)的ROC曲線

3 討論

NAFLD屬于常見的慢性進展性肝臟疾病，是引起終末期肝病、肝細胞癌和肝臟移植的主要原因[7]。NAFLD包括多種肝臟病理學(xué)變化，例如有些患者表現(xiàn)為脂肪變性而沒有其他肝損傷特征，而有些NASH患者會伴或不伴有肝纖維化特征。因此單純依靠肝臟病理學(xué)特征對于晚期纖維化的預(yù)測和識別意義不明顯。NASH是NAFLD患者發(fā)生肝纖維化的必經(jīng)階段，而肝纖維化的發(fā)生和進展則是NAFLD患者預(yù)后的最重要預(yù)測因素[8]。因此，早期識別肝纖維化的存在變得越來越重要。Aangulo等[9]學(xué)者證實，無論是早期肝纖維化還是進展期肝纖維化都會增加NAFLD患者的死亡風(fēng)險。

目前，肝組織活檢仍然是確認肝纖維化分期的“金標準”。在本研究中，我們納入的所有肝纖維化患者都完成了肝組織穿刺活檢，以確定診斷和進展分期的可靠性。然而，肝組織活檢由于具有侵入性、高成本以及主觀性較強等不足，而且以現(xiàn)階段穿刺活檢的技術(shù)水平，僅有部分患者可實現(xiàn)組織學(xué)檢查，使其在臨床診斷和疾病監(jiān)測方面的應(yīng)用受到一定的局限性，并且不適用于高危患者的篩查工作。此外，影像學(xué)檢查雖然能夠發(fā)現(xiàn)肝臟脂肪變性的存在，但是若缺少組織學(xué)評估，診斷肝纖維化存在一定困難。近年來，一些非侵入性的生物標記物已經(jīng)被開發(fā)出來并被證實可以用于肝纖維化診斷[10]。與肝組織活檢不同，這類標志物可在一段時間內(nèi)可反復(fù)檢測，且侵犯性小，完成度高。有研究發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化的轉(zhuǎn)化過程中，細胞外間基質(zhì)成分(ECM)被釋放到外周循環(huán)血中，一些ECM相關(guān)分子，如PCⅢ、CⅣ、LN、HA等，被用作評估肝纖維化程度的生物標志物[11]。此外，PLT下降、ALT、AST、GGT升高與肝纖維化的進展也密切相關(guān)，因此也是判斷肝纖維化嚴重程度的一類間接標志物[12]。而這些血清學(xué)標志物都具有一定的滯后性，較影像學(xué)變化出現(xiàn)得更晚，且易受其他合并病的干擾，因此，在篩查或診斷早期肝纖維化發(fā)生中特異性和靈敏度有限。在本研究中我們也發(fā)現(xiàn)肝纖維化組和非肝纖維化組NASH患者BMI、PLT、糖尿病史比例、ALT、AST、GGT、FBG、HOMA-IR、TG、LDL-C、CK-18、PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平升高高于正常對照人群，同時PLT、Alb水平低于正常對照人群；而且與非肝纖維化組患者人群相比，肝纖維化組患者GGT、CK-18、PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平進一步升高，同時PLT水平進一步降低。

在研究中，我們還發(fā)現(xiàn)肝纖維化患者血漿外泌體中LncRNA NEAT1相對表達量增加，經(jīng)多元線性回歸分析，校正各項混雜因素后，血清外泌體LncRNA NEAT1>1.77是NASH患者發(fā)生肝纖維化的重要獨立危險因素之一。Yu等[13]學(xué)者證實，在CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝組織纖維化模型中，LncRNA NEAT1表達顯著增加，而且上調(diào)NEAT1表達，通過調(diào)節(jié)miR-122/KLF6信號軸可以加速原代肝星狀細胞活化，包括增加細胞增殖和膠原蛋白表達，說明NEAT1-miR-122-KLF6信號級聯(lián)反應(yīng)是肝組織纖維化過程中的重要機制。Jin等[14]學(xué)者證實NEAT1可以促進NAFLD患者肝纖維化進程，通過脂肪酸誘導(dǎo)BRL3A細胞建立NAFLD體外細胞模型，在這個過程中，NEAT1表達量逐漸升高，并且可以海綿化吸附miR-506來抑制Gli3的表達，進而調(diào)節(jié)肝組織纖維化、炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝。上述研究均說明，LncRNA NEAT1在肝組織纖維化早期階段屬于重要的誘導(dǎo)因子。此外，分析血清外泌體與一些現(xiàn)有的肝纖維化診斷標志物的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，肝纖維化組患者血清外泌體LncRNA NEAT1相對表達量與GGT/PLT、NLR呈正相關(guān)性，GGT/PLT、NLR都是用于判斷NAFLD患者發(fā)生肝纖維化的標志性指標，加上ROC曲線分析結(jié)果，說明血清外泌體LncRNA NEAT1對于診斷NASH患者肝纖維化的發(fā)生有一定的參考價值，且特異性極高(99.96%)；雖靈敏度不甚理想，但可作為現(xiàn)有的肝纖維化診斷生物學(xué)分子系統(tǒng)的補充性指標，包括NFS評分系統(tǒng)(包括年齡、FBG/糖尿病、BMI、PLT、ALB、AST/ALT)、FIB-4評分系統(tǒng)(包括年齡、AST、ALT、PLT)等，以彌補多數(shù)指標特異性低的缺點。本研究證實，血清外泌體LncRNA NEAT1相對表達量與肝組織纖維化進展有一定關(guān)系，輕中度肝纖維化患者血清外泌體LncRNA NEAT1相對表達量低于進展期肝纖維化患者；經(jīng)ROC曲線分析，血清外泌體LncRNA NEAT1對于進展期肝纖維化的診斷也有一定的臨床價值。Kong等[15]學(xué)者利用AdI-GFBPrP1腺病毒處理小鼠或原代肝星狀細胞建立體內(nèi)或體外肝纖維化模型后，發(fā)現(xiàn)NEAT1表達量升高，進而誘導(dǎo)細胞自噬，加重肝組織或細胞的進一步纖維化損傷。因此本研究推斷LncRAN NEAT1在肝組織纖維化進展階段也發(fā)揮著重要作用。

綜上所述，本研究證實LncRNA NEAT1水平升高可能增加了NASH患者發(fā)生肝纖維化的風(fēng)險，因此檢測血清外泌體LncRNA NEAT1相對表達量有助于協(xié)助臨床醫(yī)師對NASH患者早期肝纖維化的發(fā)生作出準確識別，并且對于判斷肝纖維化患者疾病進展也有一定的參考價值。