陳 曦 嚴(yán)峻彬 張智慧 姚嘉明 姚侃男 陳芝蕓△

1.內(nèi)江市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科 (四川 內(nèi)江， 641100) 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 3.杭州市中醫(yī)院

急性肝內(nèi)膽汁淤積性肝病是多種原因引起的膽汁形成、分泌和(或)膽汁排泄異常，膽汁不能正常流入十二指腸而進(jìn)入血液而引起的肝臟疾病[1]。膽汁的組成中超過95%為水分，水轉(zhuǎn)運(yùn)功能喪失可能造成膽汁淤積[2-4]。水通道蛋白(AQPs)是一組控制水液進(jìn)出細(xì)胞的特異性通道蛋白，對(duì)維持機(jī)體正常的水液轉(zhuǎn)運(yùn)功能起至關(guān)重要作用[2,5]。研究發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白亞型AQP8、AQP9均在肝臟中表達(dá)并參與膽汁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，其表達(dá)異?？赡軈⑴c肝內(nèi)膽汁淤積的發(fā)生發(fā)展[6，7]。三黃柴術(shù)方是項(xiàng)目組臨床上用于治療肝內(nèi)膽汁淤積的中藥復(fù)方，具清熱化濕、祛瘀疏肝作用，前期研究發(fā)現(xiàn)該方能有效防治急性肝內(nèi)膽汁淤積大鼠肝組織損傷，降低大鼠血清細(xì)胞間黏附分子-1、腫瘤壞死因子-α等炎癥因子。本研究通過建立大鼠急性肝內(nèi)膽汁淤積肝損傷模型，觀察三黃柴術(shù)方對(duì)肝組織AQP8/9表達(dá)的影響，為進(jìn)一步闡明三黃柴術(shù)方防治肝內(nèi)膽汁淤積肝損傷的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 32只雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量為130～150 g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)[SCXK(滬)2013-0016]，在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要藥物及試劑 三黃柴術(shù)方由大黃、黃柏、梔子、柴胡、白術(shù)按4∶4∶3∶3∶4比例由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑中心制備成水提液。α萘-異硫氰酸酯(ANIT)，由北京百靈威科技有限公司提供，產(chǎn)品編號(hào)249447。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒、總膽紅素(TBil)試劑盒、總膽汁酸(TBA)試劑盒均為上海森能-德賽診斷技術(shù)有限公司產(chǎn)品；TaKaRa Mini BEST Universal RNA Extraction Kit(產(chǎn)品編號(hào)9767)、PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)(產(chǎn)品編號(hào)RR036A)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus)(產(chǎn)品編號(hào)RR820A)均由寶生物工程(大連)有限公司提供；BCA法蛋白定量試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)PQ0031)、Potent ECL Kit(產(chǎn)品編號(hào)P1425)、β-actin(產(chǎn)品編號(hào)ab008-040)、Goat Anti-Mouse IgG(H+L) HRP(產(chǎn)品編號(hào) GAM007)、Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) HRP(產(chǎn)品編號(hào)GAR0072)均為聯(lián)科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；全蛋白抽提試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)KGP2100)為凱基生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；AQP8抗體(產(chǎn)品編號(hào)sc-81870)、AQP9抗體(產(chǎn)品編號(hào)sc-74409)由美國(guó)Santa Cruz公司提供。

1.3 主要儀器 日立7020全自動(dòng)生化分析儀(日本高新技術(shù)株會(huì)會(huì)社)，AB17900PCR熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，Mini-PROTEAN Tetra(美國(guó)Bio Rad公司)，F(xiàn)CE型ProteinSimple化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)ProteinSimple公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理 實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、復(fù)方高劑量組及復(fù)方低劑量組4組，每組8只。實(shí)驗(yàn)第1天開始復(fù)方高、低劑量組大鼠分別每天以20 g/(kg·d)、10 g/(kg·d)的三黃柴術(shù)方水提液灌胃1次，連續(xù)4 d；正常組和模型組每天灌服等容量的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第3天上午正常組大鼠灌服1 ml/kg麻油1次，其他3組按100 mg/kg劑量灌服1 次4% ANIT麻油溶液。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，于實(shí)驗(yàn)第5天上午空腹下行3%戊巴比妥鈉麻醉后腹腔靜脈取血，離心分離血清；取右葉部分肝組織，以10%中性甲醛固定，用于病理觀察；其余肝組織投入液氮中，3 h后移入-75℃冰箱中保存。

1.5 觀察指標(biāo) 全自動(dòng)生化儀檢測(cè)各組大鼠血清ALT、AST、ALP、TBil、TBA水平。HE染色光鏡觀察肝組織病理學(xué)變化。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)肝組織AQP8、AQP9 mRNA表達(dá)，采用相對(duì)表達(dá)量(2-△△Ct)衡量AQP8、AQP9基因表達(dá)水平，引物由生工生物工程(上海)有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表1。Western blot檢測(cè)肝組織AQP8、AQP9蛋白表達(dá)水平，AlphaView SA軟件分析各蛋白的灰度值，以β-actin為內(nèi)參衡量AQP8、AQP9蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝功能的影響情況 見表2。

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清肝功能的影響比較

2.2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織病理學(xué)的影響情況 正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，無變性壞死、膠原增生等改變；模型組大鼠肝細(xì)胞混濁腫脹，可見肝細(xì)胞脂肪變，匯管區(qū)、小葉周邊出現(xiàn)小的膽管增生和少量膠原沉積，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；復(fù)方高、低劑量組大鼠肝組織病理變化與模型組相似，但程度明顯減輕，見圖1。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) (HE染色，100×)

2.3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織AQP8/9蛋白表達(dá)的影響 見圖2。

圖2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織AQP8、AQP9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織AQP8/9 mRNA的影響 見圖3。

圖3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織AQP8、AQP9 mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論

肝內(nèi)膽汁淤積是各種原因?qū)е履懼伞⒎置谡系K或膽汁流的停滯或受阻，致使膽汁排出減少，在膽道中蓄積甚至回流入血，血中膽紅素和膽汁酸上升，肝細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)(如膽汁酸鹽)不斷積聚，造成肝臟損傷，血清中的肝臟轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)含量上升的一類臨床綜合征[8]。臨床治療上仍無特效藥物，主要使用的有熊去氧膽酸、腺苷蛋氨酸等[9]，然而對(duì)部分膽汁淤積患者并無效果。肝內(nèi)膽汁淤積屬于中醫(yī)“黃疸”范疇；三黃柴術(shù)方是項(xiàng)目組以《金匱要略》中治療陽黃的大黃硝石湯基礎(chǔ)上加減而得，由大黃、黃柏、梔子、柴胡、白術(shù)組成，具有具清熱化濕、祛瘀疏肝、利膽退黃作用。本研究發(fā)現(xiàn)，三黃柴術(shù)方能顯著降低ANIT誘導(dǎo)的急性膽汁淤積大鼠血清ALT、AST水平，提示該方可一定程度緩解肝內(nèi)膽汁淤積時(shí)的肝細(xì)胞損傷。

水通道蛋白(AQPs)對(duì)水具有特殊通透性，在多個(gè)組織和器官上表達(dá)的完整跨膜蛋白，是存在于細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)水的特異性孔道，在維持機(jī)體水代謝平衡過程中起著至關(guān)重要的作用[10]，其亞型AQP8、AQP9均在肝臟中表達(dá)并參與膽汁的轉(zhuǎn)運(yùn)過程[11,12]。研究發(fā)現(xiàn)，膽小管膽汁分泌與AQPs的選擇性表達(dá)和協(xié)同調(diào)控有關(guān)[13]。AQP8 在圍繞中央靜脈的肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜和膽囊上皮細(xì)胞上表達(dá)[14]，是肝細(xì)胞中最豐富的水通道蛋白，其主要通透水分子[15]。AQP8基因敲除小鼠膽汁分泌量明顯減少，且使用膽鹽刺激，加快膽汁分泌速度后其膽汁分泌量仍少于正常組小鼠[16]。脂多糖誘導(dǎo)的膽汁淤積癥模型中，AQP8的表達(dá)顯著下降[17]。AQP9則統(tǒng)一分布于肝小葉內(nèi)，集中于肝細(xì)胞的竇基底膜中，可以滲透水和除水以外的多種小分子中性物質(zhì)，也稱作“廣泛選擇性通道”[11,18]。研究表明，AQP9與膽汁形成過程中水的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[13,19]。通過對(duì)大鼠行膽道結(jié)扎術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)[20]，術(shù)后1～7 d中AQP9蛋白在肝細(xì)胞基底外側(cè)膜表達(dá)明顯減少，而在細(xì)胞內(nèi)膜表達(dá)顯著增加，7 d以后結(jié)扎大鼠肝細(xì)胞膜上表達(dá)的AQP9總量下降，導(dǎo)致基底膜滲透水的功能下降，大量膽汁堆積在肝細(xì)胞內(nèi)。本研究發(fā)現(xiàn)，ANIT誘導(dǎo)的急性膽汁淤積性肝損傷大鼠肝臟AQP8/9表達(dá)水平下降，同時(shí)，ALT、AST、ALP、TBil、TBA水平明顯增高，提示性膽汁淤積時(shí)肝組織AQP8/9下調(diào)導(dǎo)致其介導(dǎo)水轉(zhuǎn)運(yùn)的能力降低，肝細(xì)胞膜對(duì)水的通透性減低，致使膽汁分泌失常，出現(xiàn)肝損傷；三黃柴術(shù)方能在一定程度上拮抗AQP8/9的低表達(dá)，降低膽汁酸分泌和保護(hù)肝細(xì)胞，提示三黃柴術(shù)方可能通過調(diào)節(jié)AQP/9的表達(dá)而改善ANIT誘導(dǎo)的急性肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷。