張 揚 駱建興 楊 芳 扈曉宇

成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院感染科 (四川 成都， 610072)

間歇性禁食也稱輕斷食，是一種正常飲食和禁食交替進(jìn)行的飲食療法，包括時間限制禁食、隔日禁食和周期性禁食等。由于患者較易堅持，間歇性禁食在人群中流行較廣。作為全球性公共衛(wèi)生問題，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制復(fù)雜，其中氧化應(yīng)激及胰島素抵抗(IR)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。動物實驗和臨床研究已證實，隔日禁食可在短期內(nèi)改善NAFLD及肝臟氧化應(yīng)激[1-3]。先前研究表明，隔日禁食結(jié)合濟(jì)饑辟谷方能控制小鼠體質(zhì)量增加和良性調(diào)節(jié)血糖、血脂[4]，但兩者結(jié)合對NAFLD的影響尚未見報道。故本文研究隔日禁食結(jié)合濟(jì)饑辟谷方對NAFLD大鼠肝臟氧化應(yīng)激及胰島素受體底物(IRS)2 mRNA的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與儀器 清潔級雄性SD大鼠，5～6周齡，體質(zhì)量(160±10)g，共44只，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司[生產(chǎn)許可證為SCXK(川)2015-030]。高脂飼料(含41.6 kcal%脂肪，TP26300)和低脂對照飼料(含12.5 kcal%脂肪，TP26312)由南通特洛菲飼料科技有限公司生產(chǎn)[生產(chǎn)許可證號：蘇飼證(2014)06092]。結(jié)合文獻(xiàn)[4]，利用現(xiàn)代加工技術(shù)將濟(jì)饑辟谷方(黑豆、火麻仁、糯米等)制成干脆塊狀。BCD-236H型-70℃電冰箱(中國海爾集團(tuán)有限公司)，KDC-2046型低速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)，721型分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，7170A型全自動生化分析儀(日本日立公司)，轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(德國徠卡公司)，TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(jī)和PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)，BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)(常州郊區(qū)中威電子儀器廠)，BA400Digital型數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司)，圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics公司)。超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，4%多聚甲醛固定液(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，PBS磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，無水乙醇AR級(江蘇海興化工有限公司)，二甲苯AR級(天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，中性樹膠(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)等。

1.2 動物分組、干預(yù)及標(biāo)本采集 44只健康雄性SD大鼠，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為兩組，正常對照組(n=12)采用低脂飼料喂養(yǎng)12周；高脂飼料組(n=32) 參照文獻(xiàn)[5]方法，采用高脂飼料喂養(yǎng)12周，構(gòu)建NAFLD大鼠模型。12周后，每組各取2只處死，行病理檢測確定模型成功后，高脂飼料組隨機(jī)分為模型組、隔日禁食組、結(jié)合濟(jì)饑辟谷方組，每組10只，干預(yù)4周。隔日禁食采取第1天早9∶00投飼，第2天早9∶00撤回，如此往復(fù)。各組大鼠分籠飼養(yǎng)于(25±2)℃、明暗各12 h的動物實驗室內(nèi)，自由飲水。于實驗第16周末，大鼠禁食12 h后，4%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，股動脈取血，取肝右葉相同部位(距離肝邊緣0.5cm處)組織若干，用于相關(guān)檢測。

1.3 觀察項目 ①血脂及肝功能測定：采集的血液在4℃下3 000 r/min離心10 min，取上層血清，用全自動生化分析法檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等。②肝臟病理檢查：取肝組織置于4%多聚甲醛中固定，制備冰凍切片及石蠟切片，油紅O和TUNEL染色觀察肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和凋亡情況，HE染色觀察肝組織形態(tài)學(xué)改變。③肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)測定：取肝組織加冷生理鹽水制成10%肝勻漿，離心，取上清液，采用試劑盒檢測SOD、GSH和MDA。④肝臟IRS2 mRNA表達(dá)：用TRIzol試劑提取肝組織總RNA，利用隨機(jī)六聚體引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green 1試劑盒進(jìn)行實時RT-PCR。IRS-2引物序列(GenBankTMNM-003749)：上游：5′-ACAACAACCACAGCGTGCGC-3′，下游：5′-GTAGAGGGCGATCAGGTACTTG-3′。β-actin引物序列(GenBankTMNM-001101)：上游：5′-GCAAGAGAGGCATCCTCACC-3′，下游：5′-CGTAGATGGGCACAGTGTGG-3′。反應(yīng)體積為20 μl，含有LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green 1，4 mmol/L MgCl2，0.5 μmol/L上游和下游PCR引物及2 μl cDNA。擴(kuò)增反應(yīng)如下進(jìn)行：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，循環(huán)40次。儀器自動計算CT值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血脂及肝功能的比較 與正常對照組比較，模型組血清TC、TG、ALT、AST水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，隔日禁食組及結(jié)合濟(jì)饑辟谷方組均能顯著降低血清TC、TG、ALT、AST水平(P<0.05)，并且結(jié)合療法的效果優(yōu)于隔日禁食組。見表1。

表1 各組大鼠血脂及肝功能情況比較

2.2 各組大鼠肝臟氧化應(yīng)激及胰島素抵抗指標(biāo)的比較 與正常對照組比較，模型組肝臟MDA含量升高、SOD和GSH活性降低、IRS 2 mRNA表達(dá)下降(P<0.05)；與模型組比較，單純隔日禁食及結(jié)合濟(jì)饑辟谷方治療均能促進(jìn)肝臟MDA含量、SOD和GSH活性、IRS 2 mRNA表達(dá)的恢復(fù)(P<0.05)，并且二者結(jié)合的效果優(yōu)于隔日禁食組。見表2。

表2 各組大鼠肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)情況

2.3 各組大鼠肝臟油紅O染色的變化 正常對照組肝細(xì)胞排列整齊，間隙清晰，未見紅染脂滴。與正常對照組比較，模型組肝細(xì)胞明顯腫脹，脂質(zhì)沉積，可見彌漫性的紅染脂滴及脂滴融合。與模型組比較，隔日禁食組及結(jié)合濟(jì)饑辟谷方組均能減少脂質(zhì)沉積，其中二者結(jié)合的效果更佳。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織油紅O染色(400倍)

2.4 各組大鼠肝臟TUNEL染色的變化 正常對照組肝組織未見核呈棕褐色的凋亡細(xì)胞。與正常對照組比較，模型組肝組織內(nèi)出現(xiàn)大量棕褐色凋亡細(xì)胞。與模型組比較，隔日禁食組及結(jié)合濟(jì)饑辟谷方組均能減少凋亡細(xì)胞，其中二者結(jié)合的效果更佳。見圖2。

圖2 各組大鼠肝組織TUNEL染色(400倍)

2.5 各組大鼠肝臟HE染色的變化 正常對照組肝細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，未見明顯脂肪變性及炎性細(xì)胞浸潤。與正常對照組比較，模型組肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量大小不等的脂滴空泡，小葉中可見點狀壞死及炎性細(xì)胞浸潤，部分肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松，甚至氣球樣變。與模型組比較，隔日禁食組及結(jié)合濟(jì)饑辟谷方組均能緩解肝臟脂質(zhì)沉積、炎性細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞損傷(氣球樣變和點狀壞死)，其中二者結(jié)合的效果更佳。見圖3。

圖3 各組大鼠肝組織HE染色(400倍)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，單純隔日禁食或隔日禁食結(jié)合濟(jì)饑辟谷方均可顯著提高NAFLD大鼠肝臟抗氧化物酶活性，減輕氧化應(yīng)激，而改善肝臟脂質(zhì)沉積及肝細(xì)胞損傷，且兩者結(jié)合組的效果更優(yōu)。

NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前廣為接受的是“二次打擊”學(xué)說。第一次打擊是IR導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積，第二次打擊主要是氧化應(yīng)激致使肝臟的進(jìn)一步損害[6]。線粒體是脂肪酸進(jìn)行β-氧化和三羧酸循環(huán)、ATP合成及氧自由基(ROS)形成的主要場所。肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)超載促使過多的脂肪酸進(jìn)入β-氧化途徑，進(jìn)而增加ROS的產(chǎn)生，大量生成的ROS超過抗氧化系統(tǒng)清除能力時便發(fā)生氧化應(yīng)激。蓄積的ROS與膜磷脂的不飽和脂肪酸反應(yīng)形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(LPO)，后者又可加重線粒體損傷，增加肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和ROS產(chǎn)生，如此惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡、肝臟炎性及纖維化[7,8]。本研究結(jié)果顯示，模型組肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA含量升高，而抗氧化酶SOD、GSH活性降低。提示NAFLD大鼠脂質(zhì)過氧化增加，抗氧化酶大量消耗，繼而引發(fā)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。因而提高肝細(xì)胞抗氧化能力使之適應(yīng)脂質(zhì)超負(fù)荷，對于緩解病情具有重要意義。

隔日禁食是間歇性禁食的主要形式之一。有研究認(rèn)為，隔日禁食可以在不減少熱量攝入的情況下降低多種疾病的風(fēng)險[9]。據(jù)報道，隔日禁食可提高年齡相關(guān)性淋巴瘤小鼠脾臟SOD、GSH活性，降低MDA含量，減少ROS產(chǎn)生而延長壽命[10]。它也能增加糖尿病大鼠腎臟SOD 活性，減少MDA 含量，而延緩糖尿病腎病的進(jìn)展[11]。本研究結(jié)果表明，隔日禁食結(jié)合濟(jì)饑辟谷方可提高NAFLD大鼠肝組織抗氧化酶活性，減輕氧化應(yīng)激損傷，并對胰島素信號通路中關(guān)鍵信號分子IRS 2 mRNA表達(dá)有調(diào)節(jié)作用。

既往證實，NAFLD常存在IR，伴有高血糖、高胰島素血癥及胰島素敏感性下降。肝臟是胰島素作用的靶器官，當(dāng)存在高胰島素血癥時，肝糖輸出持續(xù)增加，加重高血糖、高胰島素血癥及IR[12]。有研究認(rèn)為，肝臟IR是NAFLD進(jìn)展的啟動環(huán)節(jié)，而肝臟局部氧化應(yīng)激的產(chǎn)生可能是誘發(fā)肝臟IR的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[13]。可以推測，隔日禁食結(jié)合濟(jì)饑辟谷方對NAFLD大鼠肝臟IR的改善作用可能與減輕氧化應(yīng)激有關(guān)。

《服氣精義論·服藥論》言：“夫五臟通榮衛(wèi)之氣，六腑資水谷之味。……又既絕谷，則腑味之不足。”又言：“谷不入半日，則氣衰；一日，則氣少。故須諸藥以代于谷，使氣味兼致臟腑而全也?！闭J(rèn)為辟谷必須服餌。有研究對古代中醫(yī)文獻(xiàn)中服餌辟谷方劑的用藥規(guī)律進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)服餌辟谷組方選藥首重安全，盡量選擇無毒無害服用安全性高的藥物；總體上用藥平和，以甘味藥與平性藥為主，遵循甘緩平補(bǔ)之法；用藥多歸脾肺二經(jīng)，著重調(diào)節(jié)辟谷期間體內(nèi)氣的生化與運行[14]。濟(jì)饑辟谷方是一個代表性的服餌辟谷組方，由黑豆、火麻仁、糯米等高蛋白食物組成，可使患者“氣足不思食”。

綜上，隔日禁食結(jié)合濟(jì)饑辟谷方能減少NAFLD大鼠肝臟脂質(zhì)沉積及肝細(xì)胞損傷，其發(fā)揮作用的機(jī)制與改善肝臟氧化應(yīng)激和IR有關(guān)。二者結(jié)合既能提高個體對饑餓的耐受性，亦可提高治療效果，對NAFLD的治療提供新思路、新方法，值得深入探討。