管佳暢 張志威 毛宇湘△

1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院中醫(yī)科 (河北 石家莊， 050011) 2.河北省中醫(yī)院脾胃病二科

肝硬化是臨床常見的慢性進(jìn)行性肝病，由一種或多種病因長期或反復(fù)作用于肝臟導(dǎo)致，是一種慢性、進(jìn)行性、彌漫性的肝病終末階段。肝硬化早期表現(xiàn)隱匿，不易察覺，晚期以肝功能減退和門脈高壓為主要臨床表現(xiàn)，常出現(xiàn)多種并發(fā)癥，如腹水、消化道出血、肝性腦病等。腹水是肝硬化失代償期最突出的臨床表現(xiàn)，大約75%以上失代償期患者會出現(xiàn)腹水[1]。腹水的形成不但影響患者生活質(zhì)量，而且增加了自發(fā)性腹膜炎、上消化道出血、腎功能衰竭或肝性腦病等風(fēng)險，提示預(yù)后不良。因此對肝硬化腹水形成機(jī)制的研究一直是臨床研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)。目前對于肝硬化腹水主張綜合治療，而中醫(yī)藥作為綜合療法中的重要組成部分，因其整體觀念強(qiáng)，能夠調(diào)理機(jī)體的內(nèi)環(huán)境，提高機(jī)體免疫功能，緩解臨床癥狀體征，改善生活質(zhì)量，防治并發(fā)癥，且無創(chuàng)傷、毒副作用小，價格便宜等，越來越受到中西醫(yī)臨床重視。 毛宇湘教授以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，并結(jié)合多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，研制出由醋鱉甲、生牡蠣、赤芍、蜜紫菀等中藥組成的具有軟肝活血、開肺利水功效的復(fù)肝春3號方(FGC-3)，臨床療效顯著[2]。本研究擬通過觀察FGC-3對肝硬化腹水大鼠血清血管活性物質(zhì)(NO、ET-1)、水通道蛋白AQP8水平的影響，以探索其利水機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動物 清潔級雄性Wistar大鼠75只，體重(200±20 g)，購于河北省實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號SCXK(冀2013-1-003)，合格證號1509127。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于河北省實(shí)驗(yàn)動物中心動物實(shí)驗(yàn)室，使用IVC實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)籠具，每籠3只，飼養(yǎng)溫度22～24℃，相對濕度40%～60%，每天明暗時間交替各12 h。普通全價顆粒飼料購自河北省實(shí)驗(yàn)動物中心。飲水瓶、瓶塞、籠具均經(jīng)滅菌處理，造模期間以15%食用酒作為飲料讓大鼠自由飲用，自由進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)人員嚴(yán)格按要求進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室并規(guī)范操作，妥善處理死亡動物，并做記錄。以上實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)及操作條件均符合《實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量管理辦法》和《河北省實(shí)驗(yàn)動物管理辦法》的要求。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 FGC-3顆粒劑由醋鱉甲2袋(批號1027064，相當(dāng)于飲片20 g)、防己1袋(批號1027479，相當(dāng)于飲片10 g)、澤蘭2袋(批號1027204，相當(dāng)于飲片20 g)、赤芍1袋(批號1027457，相當(dāng)于飲片10 g)、生白芍1袋(批號1017947，相當(dāng)于飲片10 g)、蜜紫菀1袋(批號1024779，相當(dāng)于飲片10 g)、當(dāng)歸1袋(批號1027479，相當(dāng)于飲片10 g)、生牡蠣1袋(批號1027079，相當(dāng)于飲片20 g)、桔梗1袋(批號1005479，相當(dāng)于飲片10 g)等藥組成，由廣東一方制藥有限公司提供。復(fù)方鱉甲軟肝片(批號0927236，內(nèi)蒙古福瑞醫(yī)療科技股份有限公司，規(guī)格：0.5 g×48片，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z19991011)。

1.1.3 試劑及儀器 CCl4(天津市永大化學(xué)試劑公司)，橄欖油(上海德麗莎食品有限公司)，白酒(乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%) 石家莊酒廠，一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，二抗、DAB(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，正常山羊血清、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(美國Invitrogen公司)，NO測試盒(南京建成生物工程研究所)，ET-1試劑盒(美國Cloud-Clone Corp.公司)，全自動生化分析儀(日本HITACHI 7600型)，顯微鏡(日本奧林巴斯 BX51T-PHD-J11)，多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)(美國Media Cybernetics)，酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK ELx800型)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肝硬化模型的建立及動物分組給藥 選取清潔級雄性Wistar大鼠75只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機(jī)選取8只大鼠為空白對照組(N組)，標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)14周后處死，留取標(biāo)本。剩余大鼠用改良的CCl4-乙醇綜合法進(jìn)行肝硬化腹水造模，經(jīng)腹部皮下注射40% CCl4-橄欖油溶液，每4 d 1次，首次劑量為0.5 ml/100 g，從第2次開始注射劑量改為0.3 ml/100 g，每次注藥時嚴(yán)格測量體重，以15%乙醇(由上述白酒加蒸餾水配制，下同)作為飲料，飼料均為普通飼料，持續(xù)10周。通過查腹水征及腹腔診斷性穿刺確定41只大鼠存在腹水，隨機(jī)分為5組進(jìn)行藥物治療，灌胃劑量為1 ml/100 g。模型組(M組，n=9)：灌服生理鹽水；FGC-3高劑量組(G組，n=8)：用FGC-3制劑灌胃，劑量為52 g/kg體重；FGC-3中劑量組(Z組，n=8)：用FGC-3制劑灌胃，劑量為26 g/kg體重；FGC-3低劑量組(D組，n=8)：FGC-3制劑灌胃，劑量為16.25 g/kg體重；復(fù)方鱉甲軟肝片組(F組，n=8)：用復(fù)方鱉甲軟肝片溶液灌胃，劑量為26 g/kg體重。每日1次，共4周。治療期間造模組仍以40% CCl4-橄欖油溶液按0.3 ml/100 g體重于大鼠腹部皮下注射，每周1次，至14周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死大鼠，留取標(biāo)本。

1.2.2 取材 藥物干預(yù)1個月后，所有大鼠禁食12 h以上，稱重大鼠后摘眼球取血，收集約5 ml血液于無菌試管中，離心，分離血清，密封，-40℃凍存，以備血清ELISA檢測。頸椎脫臼法處死各組大鼠，剖開大鼠腹腔，抽取腹腔積液；觀察肝臟的顏色、質(zhì)地，取大鼠肝組織，置于凍存管，并迅速將其低溫保存于液氮罐內(nèi)，用于檢測AQP8。選取同一部位肝組織，浸泡于4%中性甲醛固定液中，以做HE染色切片。

1.2.3 觀察指標(biāo)與方法 ①一般情況：觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、活動度、皮毛色澤、飲食、二便、體重變化及死亡情況。②腹腔積液量：脫頸處死大鼠后，沿腹中線剪開3.0 cm，以無菌注射器抽取腹腔內(nèi)液體，記錄腹腔積液量。③肝功能指標(biāo)：以全自動生化儀檢測天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、白蛋白(Alb)。④肝纖維化指標(biāo)：放射免疫法測定透明質(zhì)酸酶(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)。⑤血清NO：嚴(yán)格按試劑盒操作說明書用硝酸還原酶法測定其吸光度(OD)值。⑥血清ET-1：嚴(yán)格按試劑盒操作說明書用ELISA法定量測定其OD值。⑦免疫組化測定肝組織AQP8使用形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對照片進(jìn)行分析，測定陽性反應(yīng)物的積分光密度(IOD)值。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 本實(shí)驗(yàn)造模大鼠死亡率為20.9%，腹水形成率為61.19%。N組大鼠精神狀態(tài)良好，活動正常，皮毛、飲食、二便無明顯改變，體重逐漸增加。M組大鼠出現(xiàn)明顯的腹部脹大、精神萎靡、易驚、活動減少、皮毛干枯毛躁泛黃易脫落、飲食減少、尿量減少、大便灰白、體重先減輕后增加。第1～4周組大鼠體重逐漸下降10～30 g，第5周無明顯變化，個別大鼠體重下降約10 g，第6～10周約80%大鼠體重逐漸上升20～60 g。經(jīng)治療，G、Z、D、F組大鼠上述情況均有不同程度改善，體重增加，其中G組大鼠改善最明顯，其次為Z組，D組、F組相比無明顯差異。

2.2 肝組織外觀形態(tài)的比較 肉眼觀察大鼠肝組織，N組肝臟質(zhì)地好，色鮮紅，表面光滑，邊緣銳利，大小適中；M組肝臟質(zhì)脆，色暗紅或褐色，表面凹凸不平，可見大小不等的結(jié)節(jié)，邊緣較鈍，體積變??；D組肝臟腫大、質(zhì)脆，色褐色，表面粗顆粒狀，邊緣較鈍；G、Z、F組肝臟腫大，色深紅，表面尚光滑，可見不同程度細(xì)小顆粒狀區(qū)域，邊緣較銳利。

2.3 各組大鼠腹水量的比較 見表1。

表1 各組大鼠腹水量情況比較

2.4 各組大鼠肝功能指標(biāo)情況 見表2。

表2 各組大鼠肝功能情況比較

2.5 各組大鼠肝纖維化指標(biāo) 見表3。

表3 各組大鼠肝纖維化指標(biāo)情況比較

2.6 FGC-3顆粒劑作用各組大鼠后對NO、ET-1、AQP8 IOD值的影響 見表4。

表4 各組大鼠NO、ET-1、AQP8 IOD值的比較

2.7 光鏡下觀察 見圖1。 N組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常，圍繞中央靜脈呈放射狀整齊排列，未見炎癥、變性或壞死等病理改變。M組多數(shù)正常肝小葉結(jié)構(gòu)明顯破壞，出現(xiàn)廣泛的變性、出血、炎癥等病理改變，典型假小葉廣泛形成。與M組比較，各治療組肝臟結(jié)構(gòu)均見不同程度減輕，G組最明顯。G組肝小葉結(jié)構(gòu)輕度破壞，可見纖維組織增生，未見假小葉，脂肪變性消失，肝細(xì)胞輕微充血腫脹，較少炎性細(xì)胞浸潤。Z組可見纖維間隔減少，少量假小葉形成，脂肪變性基本消失，可見少量炎性細(xì)胞浸潤。D組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成明顯，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，可見變性、出血等病理改變，較M組有改善，但程度不明顯。F組肝小葉結(jié)構(gòu)中度破壞，部分假小葉形成，可見炎性細(xì)胞浸潤。

圖1 各組大鼠的肝臟病理(HE染色)

3 討論

我國是慢性病毒性肝炎大國，僅慢性乙型肝炎病毒感染者就達(dá)9 300萬人；且隨著人們生活條件的改善，酒精性肝病、脂肪性肝病的患病率日益增高；大氣環(huán)境的改變，藥物的不合理應(yīng)用導(dǎo)致的藥物性肝炎、自身免疫性肝炎、隱源性肝炎的患病率也逐漸升高，這些肝臟疾病均可導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生變性、壞死、再生，反復(fù)進(jìn)行，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟彌漫性纖維化、再生結(jié)節(jié)和假小葉形成，發(fā)展為肝硬化[3]。 肝硬化是消化系統(tǒng)的常見病，年發(fā)病率為17/100 000，且多見于20～50歲的男性，其中城市男性50～60歲的患病者的病死率高達(dá)112/100 000，我國肝硬化患者大多數(shù)為肝炎后肝硬化，少部分為酒精性肝硬化和血吸蟲性肝硬化。有資料表明，腹水形成后1年死亡率15%，2年死亡率44%，5年生存率為14%～88%[4]。因此對肝硬化腹水形成機(jī)制的研究一直是臨床研究的熱點(diǎn)、難點(diǎn)，其對指導(dǎo)臨床用藥，進(jìn)而改善肝硬化腹水患者生活質(zhì)量及壽命有重要意義。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝硬化腹水的形成是門靜脈高壓和肝功能減退共同作用的結(jié)果，其過程復(fù)雜，可涉及多種因素，主要有門靜脈壓力增高、血漿膠體滲透壓下降、神經(jīng)體液因素、肝腸淋巴液形成增多而漏入腹腔形成腹水等[5]。一方面，肝硬化時會出現(xiàn)全身血流動力學(xué)的變化，形成心輸出量增加、低外周血管阻力的高動力循環(huán)狀態(tài)，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，這是由于肝功能減退和側(cè)支血管開放，使得肝臟對部分血管活性物質(zhì)(如NO、ET)滅活減少所致。這些血管活性物質(zhì)可能介導(dǎo)了肝硬化門靜脈高壓癥高動力循環(huán)狀態(tài)的形成、維持和發(fā)展過程，參與了腹水的形成[6,7]。另一方面，則是與某些體液因素相關(guān)，如抗利尿激素、AQP等。AQP是一組對水有高選擇性的細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是跨膜水轉(zhuǎn)運(yùn)的重要通道[8]。肝細(xì)胞上有多種AQPs，其中以AQP8的表達(dá)最高。AQP8表達(dá)缺乏可能導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、水液代謝失調(diào)，從而引起肝硬化、腹水等相關(guān)疾病的發(fā)生[9]。

肝硬化腹水，屬于中醫(yī)“鼓脹”范圍。諸多醫(yī)家將鼓脹的病因歸結(jié)于酒食不節(jié)、情志刺激、蟲毒感染、病后續(xù)發(fā)四個方面，其病機(jī)為肝、脾、腎受損，氣滯、血瘀、水停腹中。病理因素不外乎氣滯、血瘀、水濕，三者各有側(cè)重，又相互為因，錯雜為病。對其治療，歷代醫(yī)家多從肝脾腎論治。病性總屬本虛標(biāo)實(shí)，表示為主者當(dāng)根據(jù)氣、血、水的偏盛，分別采用行氣、活血、祛濕利水或暫用攻逐之法；本虛為主者，當(dāng)根據(jù)陰陽的不同，分別采取溫補(bǔ)脾腎或滋養(yǎng)肝腎法，同時配合行氣活血利水，以補(bǔ)虛不忘實(shí)，瀉實(shí)不忘虛為原則[10]。毛宇湘教授結(jié)合多年治療肝硬化腹水的臨床經(jīng)驗(yàn)，提出肝硬化腹水從肺論治的理論，這是由肺的生理特性和生理功能決定的。肺為華蓋，為水之上源，主通調(diào)水道，通過肺的宣發(fā)肅降實(shí)現(xiàn)；肺主氣，人體的整個水液代謝過程，也都要依賴于氣的推動而完成。《素問·經(jīng)脈別論篇》中有云：“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調(diào)水道，下輸膀胱，水精四布，五經(jīng)并行……”，強(qiáng)調(diào)肺在水液疏布方面的作用。相對應(yīng)的肝硬化腹水的治療原則即為宣肺利水，《素問·湯液醪醴論》中有“平治于權(quán)衡，去宛陳莝……開鬼門，潔凈府”的論述，此處的開鬼門，即為宣肺利水。

在此理論指導(dǎo)下，毛宇湘教授結(jié)合多年治療肝硬化腹水的臨床經(jīng)驗(yàn)，提出頑固性肝硬化腹水從肺論治的思路，并研制出具有軟肝活血、開肺利水功效的復(fù)肝春3號方，方中醋鱉甲、生牡蠣為君，軟肝為本，二者均入肝經(jīng)血分，味咸，咸能軟堅(jiān)散結(jié)。肝為血臟，體陰用陽，且血瘀是肝硬化腹水中的一個重要病理因素，故用當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血柔肝，赤芍等活血化瘀；又肺為水之上源，主通調(diào)水道，故用桔梗、蜜紫苑開肺氣，理三焦，通調(diào)水道，共為臣藥。澤蘭、防己等利水消腫，為佐使藥。本研究顯示FGC-3可明顯改善肝硬化腹水大鼠的一般情況，減少腹腔積液量，減輕肝組織炎癥及肝纖維化程度，降低模型大鼠血清NO、ET-1水平，提高肝硬化腹水大鼠AQP8的表達(dá)，可能是其利水的作用機(jī)理。