林夢君，賈申宗，余維鵬，張文雅，盧榮華＊

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007）

草魚（Ctenopharyngodon idella）是我國淡水養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的經(jīng)濟(jì)魚類，具有生長速度快、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)，深受消費(fèi)者的喜愛。但在集約化養(yǎng)殖過程中，飼料中脂肪和碳水化合物含量過高，營養(yǎng)組成不平衡，導(dǎo)致草魚體內(nèi)能量代謝平衡被打破[1]，經(jīng)常出現(xiàn)脂肪異位蓄積、抗應(yīng)激能力下降等問題。因此，如何提高草魚對糖脂的利用能力、改善體內(nèi)脂質(zhì)蓄積以及提高魚體免疫力已顯得非常迫切。

腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor α,TNFα）是一種細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以結(jié)合其受體（TNFR），通過招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（Tumor necrosis factor receptor-associated factor,TRAFS）家族分子（如TRAF1、TRAF2）調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的許多生物過程[2]。在青石斑魚（Epinephelus awoara）、金鯧魚（Trachinotus ovatus）的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TRAF2可促進(jìn)神經(jīng)壞死病毒（RGNNV）的復(fù)制過程[3]。對草魚的研究發(fā)現(xiàn)，在草魚頭腎中TNF-α可上調(diào)TRAF1和TRAF2的 表 達(dá)[4]，說 明TNF-α、TRAF1和TRAF2在機(jī)體免疫中發(fā)揮重要作用。

本研究采用高糖高脂飼料飼喂草魚，飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測草魚肝臟、肌肉和脂肪組織中TNF-α、TRAF1和TRAF2的表達(dá)變化，研究結(jié)果可為進(jìn)一步探討三種基因在草魚脂肪蓄積及營養(yǎng)調(diào)控中的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購自TaKaRa公司（大連），本實(shí)驗(yàn)引物合成由Invitrogen基因公司提供。

1.2 高糖高脂飼料對草魚肝臟組織脂肪蓄積的影響

選取平均初始體重39.98 ±0.84g的草魚180尾，隨機(jī)分為2組：對照組和高糖高脂飼料組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾魚，實(shí)驗(yàn)飼料配方及營養(yǎng)組成與本課題組已發(fā)表的文獻(xiàn)一致[5]。在河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)兩周，養(yǎng)殖桶容量為200L，水溫23～26℃，溶解氧5.0mg/L以上，水交換量1L/min，氨基氮＜0.01mg/L，光照周期為12L:12D。在正式實(shí)驗(yàn)前，先將草魚用對照組飼料馴化一周，每天8:30、13:00和17:30飼喂3次，正式養(yǎng)殖65d。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每桶取6尾魚的肝臟于4%多聚甲醛中固定、石蠟包埋、切片、HE染色、封片、電子顯微鏡下觀察肝臟組織病理變化。

1.3 高糖高脂飼料對草魚TNF-α、TRAF1及TRAF2基因表達(dá)的影響

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每桶取3尾草魚，將草魚麻醉后立即于無菌條件下解剖分離脂肪、肝臟和肌肉組織，液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆?。使用qRT-PCR技術(shù)，檢 測 脂 肪、肝 臟 和 肌 肉 中TNF-α、TRAF1和TRAF2的相對表達(dá)量。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

表1 實(shí)時(shí)熒光定量引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析。不同小寫字母表示具有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚肝臟組織HE染色

由圖1可見，與對照組（圖1A）相比，高糖高脂飼料組的草魚肝臟細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，細(xì)胞核明顯移位，且出現(xiàn)大量大的脂滴（圖1B）。

圖1 高糖高脂飼料飼喂對草魚肝臟組織脂肪蓄積的影響（HE，×100）

2.2 高糖高脂飼料對草魚TNF-α、TRAF1和TRAF2基因表達(dá)的影響

采 用qRT-PCR技 術(shù) 檢 測TNF-α、TRAF1和TRAF2基因在肝臟、脂肪和肌肉組織中的表達(dá)量（圖2，圖3，圖4）。結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖高脂飼料可以顯著降低草魚肌肉組織中TNF-α、TRAF1和TRAF2的表達(dá)（P＜0.05），但三個(gè)基因在脂肪組織中均顯著升高（P＜0.05），在肝臟組織中僅TRAF1的表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），TNF-α和TRAF2的表達(dá)量均無顯著性變化（P＞0.05）。

圖2 TNF-α在草魚不同組織中的表達(dá)

圖3 TRAF1在草魚不同組織中的表達(dá)

圖4 TRAF2在草魚不同組織中的表達(dá)

3 討論

本研究中，從肝臟組織學(xué)形態(tài)結(jié)果來看，高糖高脂組的草魚肝細(xì)胞中脂滴明顯增多，甚至出現(xiàn)了炎性細(xì)胞浸潤，這與斑馬魚[7]中的研究結(jié)果類似。

眾所周知，脂肪組織可以分泌多種細(xì)胞因子，TNF-α就是脂肪組織產(chǎn)生的一種多效應(yīng)細(xì)胞因子。在本研究中，與對照組相比，高糖高脂可誘導(dǎo)草魚脂肪組織中TNF-α、TRAF1及TRAF2的表達(dá)增加，說明TNF-α、TRAF1和TRAF2可在脂肪組織中表達(dá)并分泌，導(dǎo)致脂肪組織炎癥的發(fā)生，并可能引起胰島素抵抗，進(jìn)而誘發(fā)多種代謝性疾病[8]。姜志浩等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與正常日糧相比，高脂日糧飼喂的大鼠脂肪組織中TNF-α基因mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)，誘導(dǎo)脂肪組織中炎癥的發(fā)生，與本研究結(jié)果一致。

肝臟是魚類糖脂代謝的重要器官，對魚體內(nèi)糖脂代謝的平衡至關(guān)重要。本研究中發(fā)現(xiàn)高糖高脂飼料可引起草魚肝臟中TRAF1的含量顯著升高且肝臟脂肪過量蓄積，唐祝奇[10]研究也發(fā)現(xiàn)，TRAF1在胰島素抵抗的小鼠肝臟組織中明顯升高，敲低TRAF1的表達(dá)后可減輕高脂誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積。Chen等[11]發(fā)現(xiàn)在高脂條件下，肝細(xì)胞特異性缺失TRAF2不會改變肝臟炎癥和胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但可減輕飲食誘導(dǎo)的高血糖，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)高糖高脂飼料飼喂后肝臟中TRAF2的表達(dá)未發(fā)生變化，提示我們可能是TRAF1而不是TRAF2在肝臟中發(fā)揮重要的營養(yǎng)調(diào)節(jié)作用。周嫚[12]研究發(fā)現(xiàn)，高脂飼喂可導(dǎo)致團(tuán)頭魴肝臟中脂肪含量增加，TNF-α表達(dá)量顯著增加，推測TNFα可能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成和脂肪酸的β氧化來參與調(diào)控機(jī)體脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)。本研究顯示高糖高脂并沒有引起肝臟中TNF-α和TRAF2的含量發(fā)生變化，可能原因是在草魚肝臟組織中，是TRAF1作為炎癥通路的主要轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白通過靶向某一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子進(jìn)而導(dǎo)致肝臟脂肪變性和炎癥發(fā)生，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究也檢測了草魚肌肉組織中TNF-α、TRAF1和TRAF2的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)高糖高脂組這三個(gè)基因的表達(dá)均顯著低于對照組，這可能是因?yàn)橹炯?xì)胞是分泌TNF-α的主要組織，TNF-α可以直接作用于脂肪組織，而TNF-α可能通過作用于脂肪細(xì)胞后產(chǎn)生的某些物質(zhì)間接作用于肌肉組織，以發(fā)揮不同的功能，具體作用機(jī)制仍需要深入研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高糖高脂飼料可引起草魚肝臟脂肪過度蓄積，且對草魚TNF-α、TRAF1和TRAF2基因在不同組織中的mRNA表達(dá)水平影響不同，而這些組織也是魚類脂肪沉積及能量代謝的主要部位，提示TNF-α、TRAF1與TRAF2可能在高糖高脂誘導(dǎo)的脂肪沉積和炎癥中發(fā)揮不同的作用，這為進(jìn)一步探討這三個(gè)基因?qū)Ω吣芪镔|(zhì)的響應(yīng)機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。