張耀玲,陳榮信,荊 丹,黃 重,魏芳勤,劉 勇

(1.漢中市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣與培訓(xùn)中心,陜西，漢中 723000；2.榆林市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心, 陜西 榆林 719000)3.留壩縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心, 陜西 留壩 724100)

0 前言

秦巴山區(qū)已成為中國(guó)西北地區(qū)規(guī)模最大的食用菌生產(chǎn)基地。秦巴山區(qū)氣候溫潤(rùn)，當(dāng)?shù)禺a(chǎn)出的黑木耳品質(zhì)好，肉質(zhì)較厚，商品性強(qiáng)；秦巴山區(qū)有豐富的林木和農(nóng)作物秸稈資源，黑木耳野生資源遍布山區(qū)，栽培黑木耳有獨(dú)特的地理優(yōu)勢(shì)、原料優(yōu)勢(shì)和資源優(yōu)勢(shì)[4]。因此提高我省黑木耳品種產(chǎn)量和品質(zhì)，增加食用菌產(chǎn)業(yè)效益，提高種植戶和企業(yè)收入，推動(dòng)秦巴山區(qū)食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。但是，近年來市場(chǎng)上對(duì)黑木耳品種管理混亂，存在相互引種并自主命名的不良現(xiàn)象，導(dǎo)致栽培黑木耳菌株貌似種類很多，但實(shí)際上大多是同一個(gè)木耳品種冠以不同的名稱，這給新品種栽培管理、品種審定、品種推廣帶來很大的難題[1]。然而傳統(tǒng)的生物學(xué)形態(tài)鑒別的方法易受環(huán)境因素和營(yíng)養(yǎng)條件的影響，周期較長(zhǎng)，鑒別結(jié)果分歧較大[2]。所以對(duì)黑木耳種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，鑒定品種，明確菌株間的親緣關(guān)系是目前迫在眉睫的工作。筆者研究通過對(duì)木耳ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)合拮抗實(shí)驗(yàn)，對(duì)13個(gè)木耳種質(zhì)資源進(jìn)行了親緣關(guān)系分析鑒定。

1 材料方法

1.1 供試菌株

陜西漢中黑木耳主栽品種12個(gè)(表1)，保藏于漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所食用菌實(shí)驗(yàn)室。其中13號(hào)野生菌株為采自周邊無人工栽培黑木耳的深山，采樣后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌株分離工作。

表1 供試品種

1.2 供試菌株的分離純化及培養(yǎng)

1.2.1 菌絲生長(zhǎng)速度的測(cè)定 采用平板培養(yǎng)法，于25℃黑暗培養(yǎng)，采用十字交叉法測(cè)定黑木耳菌落直徑。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 拮抗試驗(yàn) 每個(gè)平板均接入3種木耳菌株，25℃下培養(yǎng)15～20 d，觀察菌種相交區(qū)域之間是否有拮抗現(xiàn)象發(fā)生和拮抗線是否明顯，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3 DNA提取

采用PDA液體培養(yǎng)基，150 rpm，25℃ 培養(yǎng)菌絲，菌絲生長(zhǎng)致密后，收集菌絲于-20℃保存?zhèn)溆茫捎肅TAB法提取DNA。

1.4 ITS反應(yīng)體系

通用引物ITS1和ITS4各1 μL，DNA:1 μL，2*Mix:10 μL，PCR總體積20 μL，PCR完畢后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，送測(cè)序。

1.5 ITS系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

采用軟件ClustalW 2.0，進(jìn)行DNA序列比對(duì)，用MEGA 6.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 木耳菌絲生長(zhǎng)特性

如表2所示，被測(cè)試木耳菌株菌絲特征差異較大，主要表現(xiàn)在菌絲形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)速度、耳基出現(xiàn)的時(shí)間及色素分泌情況。菌絲生長(zhǎng)速度最快的是菌株Cxin6，吃料能力最強(qiáng)的菌株是C657；菌株C916生長(zhǎng)速度最緩慢，菌絲吃料能力也較差；菌株菌株G2和G1耳基出現(xiàn)的最晚，菌株L2611耳基出現(xiàn)的最早，菌株G2 、S16、CO2無色素分泌，菌株L2611和S1與其他菌株之間生長(zhǎng)速度差異達(dá)到了極顯著水平。漢中首個(gè)通過省級(jí)登記的黑木耳品種S1菌絲較白皙，分泌出黃褐色色素，菌絲粗壯、濃密。自分離的zbxin菌絲體白皙，分泌出深黃褐色色素，菌絲粗壯、較濃密、絮狀，菌絲生長(zhǎng)速度較快，吃料能力強(qiáng)。

表2 木耳菌絲體形態(tài)特征

2.2 黑木耳菌株ITS-PCR結(jié)果

用引物ITS1和ITS4將基因組DNA擴(kuò)增后，經(jīng)核酸電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)目的片段都在500～750 bp之間，如圖1所示。用軟件ClustalW 2.0，進(jìn)行DNA序列比對(duì),然后構(gòu)建進(jìn)化樹，如圖2所示。

圖1 木耳菌絲ITS PCR電泳

圖2 基于ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

從進(jìn)化樹來看，T16與zbxin親緣關(guān)系最近，菌絲特性幾乎完全一致。木耳S1與菌株T261、L2611、L261-1、Cxin6、C657聚類在一個(gè)分支上，可能是相似的品種，親緣關(guān)系最近，它們的菌絲生長(zhǎng)速度基本一致，菌絲濃密，都有色素分泌，菌絲其他特征基本相似。從進(jìn)化樹來看G1和G2親緣關(guān)系近，但是二者菌絲形態(tài)差異較大，主要體現(xiàn)在G1菌絲無色素分泌；C916、S16、zbxin的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，三者的菌絲形態(tài)也是差異較大。

2.3 菌株拮抗關(guān)系結(jié)果分析

選取幾組具有代表性的拮抗結(jié)果進(jìn)行分析，如圖3所示，具有親緣關(guān)系的菌株T261、L2611、L261-1與菌株S1、C657、Cxin6的菌絲兩兩之間無拮抗現(xiàn)象發(fā)生，說明三者之間親緣關(guān)系近，通過拮抗實(shí)驗(yàn)觀察這一支上的木耳菌株之間均無拮抗現(xiàn)象發(fā)生，這與進(jìn)化樹結(jié)果是一致的，同時(shí)與菌絲形態(tài)特性結(jié)果也是保持一致的。G2與CO2有很明顯的拮抗線，說明二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與進(jìn)化樹結(jié)果一致，但是G1與G2之間也有較明顯的拮抗，這與進(jìn)化樹結(jié)果不一致，菌絲形態(tài)結(jié)果也顯示二者差異較大，是由于黑木耳的形態(tài)和品質(zhì)容易受時(shí)間、環(huán)境以及生理特性等因素的影響，使基于形態(tài)學(xué)試驗(yàn)對(duì)黑木耳菌株進(jìn)行分類研究的結(jié)果不夠準(zhǔn)確[5]。菌株zbxin與C916、T16與zbxin拮抗線不明顯，說明二者親緣關(guān)系較近，進(jìn)化樹顯示二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而且菌絲形態(tài)差異也很大；C916與T16拮抗明顯，說明二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，菌絲形態(tài)差異也較大，這與進(jìn)化樹結(jié)果一致。

圖3 木耳菌絲拮抗

3 結(jié)論與討論

通過將黑木耳菌株的形態(tài)特征、拮抗試驗(yàn)以及ITS系統(tǒng)發(fā)育樹三者結(jié)合起來，綜合分析了秦巴山區(qū)13個(gè)黑木耳菌株的遺傳多樣性，這將給zbxin菌株進(jìn)行栽培選育工作奠定了一定的基礎(chǔ)。劉華晶等采用ITS對(duì)采自黑龍江省的33株野生黑木耳資源和8個(gè)本省常見栽培木耳品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑龍江野生黑木耳遺傳位點(diǎn)豐富，黑木耳栽培菌株遺傳多樣性沒有野生菌株豐富[3]。錢雪婷等采用ITS方法對(duì)秦巴山區(qū)黑木耳菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明：秦巴山區(qū)黑木耳菌株遺傳多樣性較為豐富，菌株親緣關(guān)系較近，有的幾乎沒有差異，可能是相互引種，為同一木耳品種[5]。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)菌株zbxin菌絲活力旺盛，吃料能力強(qiáng)，菌絲粗壯，將zbxin的ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，下載序列同源性較高的15個(gè)黑木耳ITS序列，再用MEGA 6.0軟件中鄰接法模型構(gòu)建出系統(tǒng)進(jìn)化樹，zbxin 與ear fungus HQ388371.1、Auricularia sp.91 KJ679440.1和Auricularia heimuer voucher MG925224.1三個(gè)黑木耳菌株同源性最高，都達(dá)到了100%相似性，說明它們的同源性很高，親緣關(guān)系很近，而且在圖4中顯示它們?cè)谶M(jìn)化樹也為同一分支上，但并不能代表它們與供試菌株就是同一木耳菌株。Zbxin與菌株MG925224.1、JN712676.1遺傳距離較遠(yuǎn)，親緣關(guān)系遠(yuǎn)。KM583898.1、JN043322.1、HQ38872.1等7個(gè)為一支，它們遺傳距離最近，親緣關(guān)系近，但在進(jìn)化樹上這些菌株與zbxin遺傳距離最遠(yuǎn)，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。zbxin ITS序列與剩余的13條ITS序列幾乎都達(dá)到了99.6%的相似性，說明雖然zbxin從秦巴山中采樣分離獲得，但是通過ITS方法鑒定其與其他木耳菌株親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，差異不是非常顯著，這表明我們目前收集到木耳品種雖然存在著一定的遺傳差異，但親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性不豐富。因此我們可以擴(kuò)大樣本搜集范圍，跨越到山西，山東，東北等木耳主產(chǎn)區(qū)，同時(shí)采用兩種以上的方法結(jié)合起來對(duì)采集的木耳菌株資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，這樣使得我們的研究結(jié)果覆蓋范圍更廣、更準(zhǔn)確。

圖4 基于rDNA ITS堿基序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹