張 微，洪 波，柳 安，袁夢(mèng)雅，王靜華，王 濤

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心老年科，上海 200030)

人類基因組中約有80%的非編碼RNA(noncoding RNA,ncRNA)，在基因表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工中起著至關(guān)重要的作用[1]，參與神經(jīng)退行性疾病病理生理過程[2-3]。遺忘型輕度認(rèn)知功能損害(amentia mild cognitive impairment,aMCI)被認(rèn)為是阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)早期認(rèn)知障礙階段[4]。本研究通過微陣列檢測(cè)分析aMCI血漿中ncRNA差異表達(dá)，基于數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)網(wǎng)絡(luò)中差異信使RNA(messenger RNA，mRNA)共表達(dá)基因進(jìn)行了基因本體論(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析，深入了解與aMCI相關(guān)的ncRNA有利于為AD開發(fā)潛在的新型生物標(biāo)志物和治療提供新策略[5]。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究選取來自中國縱向老齡化隊(duì)列研究(CLAS，ClinicalTrials.gov標(biāo)識(shí)符：NCT03672448)的受試者5例為aMCI組，同時(shí)選取5例正常人為正常對(duì)照組(normal control,NC)。兩組性別、年齡和教育水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①認(rèn)知能力在數(shù)月至數(shù)年中逐漸下降；②維持日常生活能力的獨(dú)立性；③缺乏血管、外傷或其他醫(yī)學(xué)原因?qū)е抡J(rèn)知能力下降的記憶障礙證據(jù)；④認(rèn)知下降不足以滿足AD的標(biāo)準(zhǔn)；⑤腦18F-Flutemetamol-PET掃描Aβ陽性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①混合或血管性癡呆者；②其他疾病所致認(rèn)知障礙或癡呆者。

所有受試者或其監(jiān)護(hù)人均提供了書面知情同意書，本研究通過上海市精神中心倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2血漿收集及RNA提取 收集受試者5 mL外周靜脈血于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管中，4 ℃、3 000 r/min,分離心15 min后分離上層血漿。按照說明操作步驟采用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)進(jìn)行樣品總RNA抽提，使用QIAGEN RNeasy Mini Kit(Qiagen，德國)純化。RNA的濃度和純度通過NanoDrop ND-1000(Thermo Fisher，美國)進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格后進(jìn)行后續(xù)的芯片實(shí)驗(yàn)。

1.3生物芯片技術(shù)測(cè)定基因表達(dá)譜及分析 應(yīng)用miRCURY LNATM microRNA芯片(Exiqon，丹麥)測(cè)定血漿中微小RNA(microRNA,miRNA)表達(dá)譜，雜交方法按照制造商的說明書進(jìn)行，雜交完成后使用Wash buffer kit(Exiqon，丹麥)清洗芯片，Axon GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片，GenePix Pro 6.0讀取芯片掃描圖像，并提取探針的信號(hào)值，對(duì)全部芯片進(jìn)行中值標(biāo)準(zhǔn)化。通過Arraystar人類長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)V4.0芯片測(cè)定血漿中mRNA和lncRNA的表達(dá)水平，根據(jù)說明書進(jìn)行操作，雜交完成后洗滌芯片，固定并使用Agilent DNA微陣列掃描儀掃描，Agilent特征提取軟件(版本11.0.1.1)采集芯片探針信號(hào)值，使用GeneSpring GX v12.1軟件進(jìn)行芯片數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化以便進(jìn)一步分析。選取符合表達(dá)差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)對(duì)數(shù)的絕對(duì)數(shù)|log2FC|≥1和P<0.05兩個(gè)條件miRNA，即lncRNA和mRNA為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因。

1.4lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用PicTar 2005(http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/PicTar_vertebrat)、miRanda v5(http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5)和TargetScan 5.1(http://www.targetscan.org/)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)非編碼RNA之間相互作用，將數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行交叉，得到lncRNA-miRNA，miRNA-mRNA之間的關(guān)系以及差異表達(dá)miRNA調(diào)控的基因。根據(jù)不同的表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果以及miRNA和lncRNA關(guān)聯(lián)分析數(shù)據(jù)，使用Cytoscape軟件分析并獲得了最終的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5差異miRNA 靶基因的功能分析 通過DAVID(http://www.david.abcc.ncifcrf.gov/)在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG分析并探討靶基因的功能作用。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)算高通量測(cè)序相關(guān)數(shù)據(jù)使用R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，設(shè)定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的lncRNA和mRNA的閾值為|log2FC|≥1和P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1miRNA芯片數(shù)據(jù)概述 Exiqon的miRNA陣列產(chǎn)生miRNA共3 100個(gè)，涵蓋在miRBase 19.0中注釋的所有人類、小鼠和大鼠miRNA，以及與這些物種相關(guān)的所有病毒miRNA，去除低質(zhì)量的miRNA、小鼠和大鼠的miRNA后，檢測(cè)到成熟miRNA 1 939個(gè)，其中aMCI組中有失調(diào)miRNA46個(gè)，包括上調(diào)miRNA13個(gè)和下調(diào)miRNA33個(gè)，見圖1A，如hsa-miR-145-3p，hsa-miR-5691，hsa-miR-3156-3p，hsa-miR-622和hsa-miR-4638-3p是下調(diào)的miRNA。進(jìn)行了miRNA表達(dá)的聚類分析，生成了一個(gè)熱圖，見圖1B。

2.2lncRNA與mRNA芯片數(shù)據(jù)概述 lncRNA微陣列芯片產(chǎn)生總共40,173個(gè)lncRNA和蛋白質(zhì)編碼mRNA20,730個(gè)，每個(gè)轉(zhuǎn)錄物均由特定的外顯子或剪接點(diǎn)探針表示，該探針可唯一地準(zhǔn)確識(shí)別單個(gè)轉(zhuǎn)錄物。aMCI組共有嚴(yán)重失調(diào)的lncRNA287個(gè)，包括上調(diào)的lncRNA67個(gè)和下調(diào)的lncRNA220個(gè)，見圖1C。通過聚類分析熱圖可視化lncRNA的表達(dá)，見圖1D。aMCI組有顯著失調(diào)mRNA208個(gè)，其中上調(diào)mRNA48個(gè)和下調(diào)mRNA160個(gè)，見圖1E，對(duì)mRNA表達(dá)進(jìn)行聚類分析生成一個(gè)熱圖。見圖1F。

圖1 遺忘型輕度認(rèn)知功能損害受試者外周血漿miRNA、ln-cRNA、mRNA表達(dá)譜A.miRNA表達(dá)火山圖;B.miRNA表達(dá)熱圖;C.lncRNA表達(dá)火山圖;D.lncRNA表達(dá)熱圖;E.mRNA表達(dá)火山圖;F.mR-NA表達(dá)熱圖Figure1 ExpressionprofilesofmiRNAs,lncRNAandmR-NAinperipheralbloodplasmaofaMCIgroup

2.3lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)ceRNA假設(shè)，ceRNA可以在調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中競(jìng)爭(zhēng)相同的MRE。一個(gè)lncRNA可以不同的方式調(diào)控多種miRNA，而一種miRNA則可以由多種lncRNA調(diào)控。使用PicTar、miRanda和TargetScan三個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)微陣列芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后有l(wèi)ncRNA 3個(gè)、miRNA 5個(gè)、mRNA 7個(gè)參與構(gòu)建了遺忘型輕度認(rèn)知功能損害ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控關(guān)系見圖2。如，lncRNA T093863與失調(diào)miRNA 70個(gè)相關(guān)聯(lián)，顯示hsa-miR-145-3p在微陣列結(jié)果中下調(diào)。LncRNA可以競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合miRNA結(jié)合，從而間接調(diào)控miRNA靶基因。

圖2 aMCI組中ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖

2.4差異miRNA 靶基因的功能分析 對(duì)差異表達(dá)的mRNA的功能進(jìn)行GO分析。GO顯示差異表達(dá)mRNA主要富集在RNA代謝過程(GO：0051252)、基因表達(dá)的調(diào)控(GO：0010468)，細(xì)胞質(zhì)應(yīng)激顆粒(GO：0010494)、細(xì)胞核(GO：0005634)、蛋白激酶B結(jié)合(GO：0043422)和微管正端結(jié)合(GO：0051010)等生物學(xué)過程，見圖3。

圖3 差異表達(dá)mRNA的靶基因GO分析

進(jìn)行KEGG通路分析以確定基因相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路，顯示8條KEGG通路與上調(diào)mRNA相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，包括單純皰疹病毒1感染，催產(chǎn)素信號(hào)、甘露糖型O聚糖生物合成、葉酸生物合成、EGFR酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性、大腸癌、甲狀腺癌和IL-17信號(hào)通路，見圖4。

圖4 差異表達(dá)mRNA的靶基因KEGG分析

3 討 論

AD是常見的神經(jīng)退行性疾病，其病理機(jī)制仍不確定，隨著中國社會(huì)進(jìn)入老齡化，該病給醫(yī)療護(hù)理和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來的負(fù)擔(dān)日益嚴(yán)峻。研究表明，ncRNA在AD病理生理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[6]，AD病理生理改變?cè)谂R床癥狀出現(xiàn)前已存在。aMCI被認(rèn)為是AD進(jìn)展的無癥狀階段，找到aMCI失調(diào)ncRNA可以促進(jìn)其作為生物標(biāo)記物的開發(fā)和AD治療的新靶點(diǎn)，對(duì)AD預(yù)防、診斷及治療均有非常重要的意義[7]。本研究中，對(duì)aMCI受試者和對(duì)照組外周血漿中的lncRNA、miRNA和mRNA表達(dá)譜進(jìn)行微陣列分析，獲得差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因，使用|log2FC|≥1和P<0.05的閾值，顯示aMCI組和NC組存在差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的上調(diào)lncRNA 67個(gè)和下調(diào)lncRNA220個(gè)，上調(diào)miRNA 13個(gè)和下調(diào)miRNA 33個(gè)，上調(diào)48個(gè)mRNA和下調(diào)mRNA 160個(gè)。使用PicTar、miRanda和TargetScan三個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)其相互作用進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過可視化的軟件 Cytoscape建立ceRNA網(wǎng)絡(luò)，揭示三者的相互作用關(guān)系。既往研究顯示，此差異表達(dá)的RNA與AD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，如SPSB1與MCI向AD的轉(zhuǎn)化有關(guān)，而NPLOC4在神經(jīng)退行性疾病(帕金森病、精神分裂癥和AD)中表現(xiàn)出多效作用[8]。

LncRNA是一種調(diào)節(jié)各種生物學(xué)功能的主要非蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本[9]。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA可以作為ceRNA干擾miRNA，發(fā)揮“海綿”的作用，從而影響其常見的mRNA功能。研究報(bào)道癌癥研究領(lǐng)域中的ceRNA機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建[10]，但對(duì)于神經(jīng)退行性疾病的ceRNA調(diào)節(jié)機(jī)制探索較少。本研究中，構(gòu)建了一個(gè)lncRNA-ceRNA網(wǎng)絡(luò)，以研究aMCI患者血漿中l(wèi)ncRNA和miRNA之間的潛在關(guān)系，以及其在AD病理生理過程中發(fā)揮的潛在作用。在本研究構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中，lncRNA T093863與SNX32彼此競(jìng)爭(zhēng)影響miR-145表達(dá)，在淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中可能發(fā)揮特定作用。研究顯示，SNX32與AD風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[10]，SNX32在aMCI血漿中表達(dá)上調(diào)，其特異性表達(dá)可能是AD的最佳生物標(biāo)志物。MiR-145在癌癥中發(fā)揮抑癌作用[11]，在AD發(fā)病過程中也擁有至關(guān)重要的作用，MiR-145可以通過Aβ-p53途徑，增強(qiáng)p53的免疫反應(yīng)性，而p53免疫反應(yīng)性與AD中淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡有關(guān)[12]。上述失調(diào)RNA或可作為早期診斷 AD 的潛在生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。尚不清楚AD中l(wèi)ncRNA T114520和lncRNA T118670的功能，但兩者均可通過調(diào)節(jié)miRNA進(jìn)而上調(diào)含C2域蛋白3的mRNA和蛋白水平。WWC蛋白家族的支架蛋白WW和含C2域蛋白3通過抑制Hippo通路中主要效應(yīng)物的轉(zhuǎn)錄活性在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，細(xì)胞遷移和突觸信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用[13-14]。在AD患者中抗Aβ抗體和γ-/β-分泌酶抑制劑的臨床試驗(yàn)失敗后[15-17]，找到新的AD治療策略至關(guān)重要。在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)中起重要作用的Hippo信號(hào)通路與MCI的早期神經(jīng)元死亡有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)生成的Aβ通過隔離YAP相關(guān)蛋白，損害YAP相關(guān)蛋白的功能進(jìn)而引起了神經(jīng)元壞死，減少了腦神經(jīng)元的數(shù)量。因此，需進(jìn)一步探索在Aβ產(chǎn)生之前的某個(gè)階段的遺傳調(diào)控機(jī)制并進(jìn)行干預(yù)，減少Aβ產(chǎn)生。lncRNA T114520和lncRNA T118670可以作為AD早期治療的潛在靶點(diǎn)，但目前對(duì)于lncRNA T114520和lncRNA T118670知之甚少，還需進(jìn)一步完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)，探索其在AD中的生物學(xué)和分析機(jī)制。在構(gòu)建的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中，本研究顯示，與淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡相關(guān)的miRNA、lncRNA和mRNA之間的新關(guān)系，為進(jìn)一步研究提供了潛在的治療靶點(diǎn)和診斷相關(guān)的生物標(biāo)志物。

本研究對(duì)ceRNA網(wǎng)絡(luò)中差異表達(dá)mRNA及其共表達(dá)基因進(jìn)行GO富集和KEGG分析，以更好地了解差異表達(dá)的RNA在AD發(fā)病機(jī)制中的生物學(xué)功能和潛在機(jī)制。GO分析顯示，其主要參與RNA代謝過程，調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞質(zhì)應(yīng)激、細(xì)胞核功能，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性和DNA相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活性等生物過程，可見在疾病早期異常調(diào)節(jié)的RNA參與了基因表觀遺傳調(diào)控及轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工過程，影響了疾病的病理生理過程。KEGG分析顯示其參與了單純皰疹病毒1感染途徑、催產(chǎn)素信號(hào)傳導(dǎo)途徑、甘露糖型O-聚糖生物合成途徑、葉酸生物合成途徑、EGFR酪氨酸激酶抑制途徑等通路。

本研究首次分析了AD無癥狀階段的aMCI患者外周血漿中失調(diào)的lncRNA、miRNA、mRNA，可作為潛在的AD早期診斷生物學(xué)標(biāo)志物，同時(shí)本研究還構(gòu)建了差異表達(dá)RNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析，顯示lncRNA T114520-has-miR-622-含C2域蛋白3等調(diào)節(jié)通路明顯失調(diào)，可能是AD發(fā)生發(fā)展的重要因素，通過調(diào)節(jié)相關(guān)通路，或可以為AD發(fā)生的分子途徑和治療策略提供新觀點(diǎn)。