陳寧,黃權(quán)華,李婷,李平飛,于紅,皮玲琳,楊星鋼,楊戰(zhàn)鏖*(. 深圳華潤(rùn)九新藥業(yè)有限公司,廣東 深圳 58000;. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院,沈陽(yáng) 006)
近年來(lái),光熱治療(photothermal therapy,PTT)因腫瘤選擇性強(qiáng),不良反應(yīng)少而被廣泛研究[1-3]。PTT作為一種非侵入性的治療方法,可用于高齡或同時(shí)患有其他疾病的患者,提高患者的順應(yīng)性[4];此外,PTT具有不良反應(yīng)少、高度特異性、不易產(chǎn)生多藥耐藥性、可重復(fù)治療等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。
PTT的重點(diǎn)就在于選擇合適的光熱材料。吲哚菁綠(indocyanine green,ICG)作為近紅外有特征吸收峰的有機(jī)三碳花菁染料,具有較高的光熱轉(zhuǎn)換率[7],且升溫迅速,ICG在激光照射下可迅速升溫并殺死腫瘤細(xì)胞[8-9]。然而,ICG的臨床應(yīng)用也存在致命的缺陷,其體內(nèi)半衰期t1/2僅有2~4 min,且極易與血漿白蛋白結(jié)合,從體內(nèi)消除,組織透過(guò)性差[10]。在水溶液及生理?xiàng)l件下濃度越高越容易發(fā)生自聚集,從而導(dǎo)致熒光猝滅失去光學(xué)活性[11-12]。
為克服上述問(wèn)題,通常將ICG搭載在載體上,以提高其穩(wěn)定性,延長(zhǎng)血液循環(huán)半衰期,提高其腫瘤蓄積率,進(jìn)一步增加PTT的療效[13-15]。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇目前應(yīng)用比較廣泛、生物相容性較好的兩性聚電解質(zhì)O-羧甲基殼聚糖(O-CMCS)和聚陽(yáng)離子載體聚乙烯亞胺(PEI)為載體,采用安全簡(jiǎn)便的聚電解質(zhì)法制備ICG納米粒,可在一定程度上提高其在生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性,增強(qiáng)組織透過(guò)性和腫瘤蓄積,用于腫瘤的PTT。
Zetasizer Nano粒度測(cè)定儀(英國(guó)Malvern公司);JEM1200EX透射電子顯微鏡(TEM日本電子株式會(huì)社);DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器(上海凌科實(shí)業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司);UV-8型紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司);808 nm激光器(PSU-H-LED公司);紅外熱像儀(Optris公司);離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司);IX71倒置熒光顯微鏡(美國(guó)Olympus公司);SpectraMax?M3多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器(上海)有限公司];激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus公司)。
吲哚菁綠(ICG,百靈威科技有限公司);O-CMCS(武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥化工有限公司);PEI(廣東翁江化學(xué)試劑有限公司);甲醇(色譜純,山東禹王化學(xué)試劑廠);Sephadex G50(Pharmacia公司);RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone公司);胰蛋白酶(Sigma公司);胎牛血清(FBS,杭州四季青生物制品公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT,美 國(guó)Sigma-Aldrich公 司);DMSO(Biochemica Applichem公司);4%多聚甲醛、Hoeches 33258、溶酶體綠色熒光探針、抗熒光猝滅封片液(碧云天生物技術(shù)研究所)。
MCF-7細(xì)胞(上海佛雷堡生物技術(shù)有限公司);小鼠腹水瘤細(xì)胞(S180,沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室)。SPF級(jí)雄性KM種小鼠(體質(zhì)量20~25 g)。
取適量ICG甲醇溶液滴加至15 mg·mL-1PEI溶液中,室溫避光攪拌10 min。室溫條件下,1000 r·min-1攪拌,將10 mg·mL-1O-CMCS以1滴·s-1的速度緩慢地滴加至PEI反應(yīng)液中,室溫避光繼續(xù)攪拌30 min,即得載藥納米粒。過(guò)0.22 μm濾膜,收集濾液于茶色西林瓶中,封口膜封好,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
采用Zetasizer Nano粒度測(cè)定儀于25℃散射角為90°的條件下測(cè)定載吲哚菁綠納米粒的粒徑、粒徑分布及zeta電位,測(cè)得納米粒粒徑為(148.7±5.6)nm,PDI為(0.072±0.028),粒徑分布圖如圖1所示,粒徑分布窄,zeta電位為-(21.7±0.35)mV。采用JEM1200EX透射電子顯微鏡觀察納米粒形態(tài)學(xué),結(jié)果如圖2所示。采用葡聚糖凝膠微柱離心法測(cè)定納米粒的包封率和載藥量分別為(72.6±3.1)%、(1.5±0.8)%。
圖1 ICG NPs粒徑分布圖Fig 1 Size distribution of ICG NPs
圖2 ICG NPs透射電鏡結(jié)果Fig 2 Transmission electron microscope of ICG NPs
光熱轉(zhuǎn)化效率是評(píng)價(jià)光熱劑性能的重要指標(biāo),良好的光熱劑在激光照射下,應(yīng)在一定時(shí)間內(nèi)迅速升至腫瘤組織敏感的溫度并保持一定時(shí)間,從而有效地殺死腫瘤細(xì)胞[16]。考察不同功率(1、2 W·cm-2)808 nm激光照射下不同質(zhì)量濃度ICG(5、10、20、30、40 μg·mL-1)和ICG NPs(5、10、20、30、40 μg·mL-1)對(duì)光熱轉(zhuǎn)化效率的影響,記錄時(shí)間-溫度變化曲線,結(jié)果見(jiàn)圖3,其Tmax光熱圖像見(jiàn)圖4。
由圖3和圖4可知,pH 7.4的PBS在不同功率的激光照射10 min內(nèi),溫度基本沒(méi)有變化,這表明激光照射不能引起PBS的升溫,可排除干擾;不同濃度的游離ICG與ICG NPs在不同功率激光照射下溫度均先升高至Tmax后下降,5 min內(nèi)可升高至Tmax,且藥物濃度越高Tmax越高,因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中照射時(shí)間選擇為5 min;功率2 W·cm-2照射下的Tmax比1 W·cm-2相同濃度的ICG均有明顯升高,因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇2 W·cm-2照射;在相同功率的激光照射下,相同的藥物濃度下,ICG NPs的升溫要高于游離的ICG,濃度在5~40 μg·mL-1,?T隨濃度的增加先增加后下降,這可能是因?yàn)镮CG濃度過(guò)大,納米粒對(duì)ICG的分散減小,ICG因?yàn)榉肿泳奂l(fā)生熒光猝滅,影響光熱效能;2 W·cm-2照射下ICG NPs升溫到Tmax所用時(shí)間明顯短于游離的ICG,這表明納米粒的包載提高了ICG的光學(xué)穩(wěn)定性和光熱轉(zhuǎn)化效率。
圖4 不同濃度ICG和ICG NPs在不同功率808 nm激光照射下的Tmax光熱圖像Fig 4 Tmax of ICG and ICG NPs at different concentrations under different power 808 nm laser irradiations
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞,消化稀釋成濃度為1×104個(gè)·mL-1的單細(xì)胞混懸液,取100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中,置于培養(yǎng)箱(5% CO2,37℃)中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞完全貼壁后,吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,加入200 μL不同質(zhì)量濃度(1、5、10、20 μg·mL-1)的游離ICG、blank-NPs、ICG-NPs(0.22 μm無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾除菌)的培養(yǎng)液溶液。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(加細(xì)胞和培養(yǎng)液而不加藥物)和空白組(只加培養(yǎng)液),每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。激光實(shí)驗(yàn)組在加藥2 h后用近紅外激光(808 nm,2 W·cm-2,10 cm)照射5 min;無(wú)激光對(duì)照組不給予照射,放入培養(yǎng)箱分別繼續(xù)孵育24 h和48 h后,避光條件下每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔各加入150 μL DMSO,振蕩使紫色結(jié)晶物完全溶解,用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm波長(zhǎng)下的吸光度(OD值)。按照Eq.1公式計(jì)算細(xì)胞存活率。
由圖5可知,在無(wú)激光照射的條件下,空白納米粒組在本實(shí)驗(yàn)考察的時(shí)間和濃度范圍內(nèi),MCF-7細(xì)胞的存活率均>85%,這說(shuō)明由O-CMCS與PEI構(gòu)建的空白納米粒具有良好的生物安全性,不會(huì)影響后續(xù)載藥納米粒對(duì)MCF-7細(xì)胞的毒性評(píng)價(jià)。不同質(zhì)量濃度的游離ICG溶液與ICG納米粒(1、5、10、20 μg·mL-1)在無(wú)激光照射的條件下與空白納米粒組相比,隨著ICG質(zhì)量濃度的增大及孵育時(shí)間的增長(zhǎng)MCF-7細(xì)胞存活率略減小,但在質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1、孵育時(shí)間為48 h,細(xì)胞存活率仍>75%,這說(shuō)明無(wú)激光照射時(shí)游離的ICG溶液與ICG納米粒均對(duì)MCF-7細(xì)胞無(wú)抑制生長(zhǎng)的作用,無(wú)細(xì)胞毒性,生物安全性良好。
圖5 空白NPs、ICG溶劑和ICG NPs對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的影響Fig 5 Cell viability of NPs,ICG solvent,and ICG NPs incubation
在2 W·cm-2,808 nm激光照射5 min的條件下,各空白納米粒組在本實(shí)驗(yàn)考察的時(shí)間和濃度范圍內(nèi),MCF-7細(xì)胞的存活率均>85%,這說(shuō)明在沒(méi)有ICG存在的條件下,單純的體外激光照射不會(huì)抑制MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)。在808 nm激光照射的條件下,當(dāng)ICG從1 μg·mL-1增加到20 μg·mL-1時(shí),MCF-7細(xì)胞孵育24 h的存活率從93.3%降到41.39%,孵育48 h的存活率從83.7%降到36.5%,這表明激光照射ICG產(chǎn)生的光熱作用可有效地殺死MCF-7細(xì)胞,隨著ICG質(zhì)量濃度的增大,細(xì)胞存活率明顯降低,細(xì)胞毒性顯著增大,但對(duì)比孵育24 h與48 h細(xì)胞存活率沒(méi)有明顯不同,這表明ICG的光熱治療具有明顯的濃度依賴(lài)性但無(wú)明顯的時(shí)間依賴(lài)性。不同濃度下ICG NPs的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用均大于游離ICG,這表明將ICG包載于O-CMCS/PEI納米粒中能夠顯著提高藥物的細(xì)胞毒性,特別是在高濃度時(shí)差別大。
MCF-7細(xì)胞,以2×105個(gè)·mL-1的濃度接種于6孔板中,置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%,吸去培養(yǎng)液,PBS清洗3次,每孔加入2 mL含ICG、ICG NPs溶液的培養(yǎng)液(不含F(xiàn)BS)后繼續(xù)孵育0.5、1、2和4 h 后,加入200 nL Lysotracker green 溶液(50 g·mL-1)繼續(xù)孵育1 h,吸去上清液,多聚甲醛固定細(xì)胞30 min,PBS清 洗3次,用10 μg·mL-1的Hoechst 33258室溫避光染細(xì)胞核10 min,移去染料,再用PBS清洗3次,取出細(xì)胞爬片反壓在載玻片上,用封片劑封片,置于激光共聚焦顯微鏡下觀察ICG納米粒的溶酶體逃逸行為,結(jié)果見(jiàn)圖6。
由圖6可知,隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng),黃色區(qū)域逐漸較少,而單獨(dú)的紅色和綠色區(qū)域逐漸變多,這說(shuō)明隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng),逐漸地有紅色熒光的ICG從溶酶體中逃逸到細(xì)胞質(zhì),這表明以O(shè)-CMCS/PEI制備的納米粒具有明顯的促進(jìn)溶酶體逃逸的功能。
圖6 MCF-7細(xì)胞中ICG NPs胞內(nèi)溶酶體逃逸Fig 6 Intracellular lysosomal escape of ICG NPs in MCF-7 cells after incubation
2.6.1 溶血性實(shí)驗(yàn) 分別取8支EP管,首先進(jìn)行編號(hào),1號(hào)設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照組,2號(hào)設(shè)為陰性對(duì)照組,3~8號(hào)設(shè)為實(shí)驗(yàn)組,按表1于每管中加入2%紅細(xì)胞懸液、生理鹽水和納米?;鞈乙?,納米粒依次加入質(zhì)量濃度為250、150、100、50、10、5 μg·mL-1。輕搖混勻后將EP管置于37℃恒溫水浴中3 h,觀察管中液體狀態(tài),若試管中的溶液呈澄明紅色狀且管底無(wú)細(xì)胞殘留則為全部溶血;若溶液澄明呈紅色或棕色且管底有少量紅細(xì)胞殘留則為部分溶血;若試管內(nèi)上層液體無(wú)色透明所有紅細(xì)胞都下沉則為無(wú)溶血。將EP管于3000 r·min-1離心5 min,吸取上清液,采用紫外分光光度法,于570 nm波長(zhǎng)測(cè)定各組上清液的吸光度值。按照Eq.2計(jì)算溶血率。
表1 ICG NPs溶血實(shí)驗(yàn)Tab 1 Hemolytic experiment of ICG NPs
ICG NPs的溶血性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示,以生理鹽水組為陰性對(duì)照組,可見(jiàn)0~3 h內(nèi)不同濃度的實(shí)驗(yàn)組管均未見(jiàn)溶血現(xiàn)象。
圖7 ICG NPs溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig 7 Hemolysis experiment for ICG NPs 1. 陽(yáng)性對(duì)照組(positive control group);2. 陰性對(duì)照組(negative control group);3~8. 實(shí)驗(yàn)組(experimental group)
ICG NPs的溶血率如圖8所示,3 h內(nèi)不同濃度的ICG NPs的溶血率均小于5%,這表明ICG NPs注射液具有良好的血液相容性,可用于后續(xù)的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。
圖8 不同濃度ICG NPs溶血率Fig 8 Hemolytic rate of ICG NPs at different concentration
2.6.2 荷瘤小鼠模型的建立 復(fù)蘇S180細(xì)胞,用適量生理鹽水稀釋使細(xì)胞混懸液達(dá)到適宜濃度后接種于KM種小鼠腹腔內(nèi),每日觀察,至小鼠腹部明顯隆起時(shí)處死,局部消毒后,抽取腹水,活細(xì)胞計(jì)數(shù)后用生理鹽水稀釋至細(xì)胞濃度為有1×107個(gè)·mL-1的腹水稀釋液,取0.2 mL腹水稀釋液接種于小鼠右腋下的皮下組織內(nèi)。建立荷瘤小鼠動(dòng)物模型。
2.6.3 分組與給藥 接種成功的荷瘤小鼠動(dòng)物模型正常飼養(yǎng)7 d左右,當(dāng)小鼠右腋下發(fā)現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的腫瘤后,測(cè)量腫瘤體積大小,選取腫瘤體積約為150 mm3的荷瘤小鼠20只,隨機(jī)分成4組,每組5只,進(jìn)行編號(hào)。分別為生理鹽水組、生理鹽水+激光照射組、ICG NPs組、ICG NPs+激光照射組。分別于小鼠尾靜脈注射相應(yīng)的制劑,ICG的給藥劑量為2 mg·kg-1,第一次給藥記為第1日,分別在第1、4和7日各給藥一次。其中激光組需要在給藥2 h和4 h后用808 nm激光(10 cm,2 W·cm-2)照射腫瘤部位5 min,正常飼養(yǎng)小鼠。
2.6.4 藥效學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo) 給藥后每日觀察小鼠的精神和活動(dòng)狀態(tài),每2日稱(chēng)量小鼠體質(zhì)量,并記錄;每2日用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)直徑(L)和最短直徑(S)大小,然后按公式Eq.3計(jì)算腫瘤體積(V):
于給藥后15 d脫頸處死小鼠,小心剝離腫瘤組織,用生理鹽水清洗干凈用濾紙擦干后稱(chēng)量瘤重,并記錄。按Eq.4計(jì)算腫瘤抑制率(tumor inhibition rate,TIR):
式中Ws為生理鹽水對(duì)照組腫瘤的平均瘤質(zhì)量,Wt為實(shí)驗(yàn)組腫瘤的平均瘤質(zhì)量。
給藥期間各組荷瘤小鼠的飲食與活動(dòng)無(wú)明顯變化,各組荷瘤小鼠的體質(zhì)量隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖9,各組荷瘤小鼠的體質(zhì)量平穩(wěn)增長(zhǎng),這說(shuō)明激光照射與ICG NPs無(wú)明顯的機(jī)體毒副作用,安全性良好。
圖9 S180荷瘤小鼠給藥15 d后體質(zhì)量變化(n=5)Fig 9 Body mass changes of S180 tumor-bearing mice after the administered for 15 days(n=5)
給藥期間記錄各組荷瘤小鼠的腫瘤體積變化,如圖10,生理鹽水+激光照射組、ICG NPs組與生理鹽水組之間無(wú)明顯差異,其腫瘤體積均隨時(shí)間的延長(zhǎng)迅速增大,表明單獨(dú)的激光照射以及ICG NPs在無(wú)激光照射下對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制效果。而ICG NPs+激光照射組的腫瘤生長(zhǎng)緩慢,第一次給藥15 d后其平均腫瘤體積為386.64 mm3,這表明ICG NPs在808 nm激光照射下具有良好的腫瘤抑制活性。
圖10 S180荷瘤小鼠在給藥15 d后腫瘤體積變化(n=5)Fig 10 Tumor volume changes of S180 tumor-bearing mice after the administered for 15 days(n=5)
給藥15 d后,摘除荷瘤小鼠的腫瘤組織稱(chēng)重,并按Eq.4計(jì)算各組的抑瘤率(TIR),結(jié)果見(jiàn)圖11、12??芍c生理鹽水組比較,生理鹽水+激光照射組與ICG NPs組腫瘤組織的平均質(zhì)量無(wú)顯著差別,TIR分別為8.7%、4.6%,ICG NPs+激光照射組抑瘤效果明顯(為75.4%),與荷瘤小鼠腫瘤體積變化趨勢(shì)大致相同,這表明僅激光照射或ICG NPs基本無(wú)明顯的腫瘤抑制作用,而ICG NPs+激光照射組可有效的抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
圖11 S180荷瘤小鼠在給藥15 d后腫瘤重量和腫瘤抑制率(n=5)Fig 11 Tumor weight and tumor inhibition rate of S180 tumor-bearing mice after the administered for 15 days(n=5)
圖12 S180荷瘤小鼠在給藥15 d后切除的腫瘤(n=5)Fig 12 Excised tumors of S180 tumor-bearing mice after the administered for 15 days(n=5)
本課題組選用生物可降解的在生理?xiàng)l件下負(fù)電荷兩性高分子材料O-CMCS和PEI為載體材料,采用聚電解質(zhì)復(fù)合法,制備了用于腫瘤的光熱治療包載近紅外光熱劑ICG納米粒ICG NPs。在808 nm激光照射下,ICG NPs具有良好的光熱轉(zhuǎn)換效率,可明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)。
通過(guò)激光共聚焦顯微鏡考察ICG NPs在MCF-7細(xì)胞中的攝取行為,結(jié)果表明ICG NPs與MCF-7細(xì)胞孵育4 h時(shí)可出現(xiàn)溶酶體逃逸現(xiàn)象。這主要是因?yàn)镻EI作為聚陽(yáng)離子聚合物,大量的伯胺及仲胺基團(tuán)在內(nèi)涵體或溶酶體的弱酸性環(huán)境中會(huì)捕獲大量質(zhì)子,與此同時(shí)也會(huì)引起大量的氯離子和水分子的內(nèi)流進(jìn)溶酶體中,導(dǎo)致溶酶體滲透性腫脹,從而使溶酶體破裂,藥物滲漏,產(chǎn)生內(nèi)涵體或溶酶體逃逸的現(xiàn)象,這就是“質(zhì)子海綿”效應(yīng)。
通過(guò)體外溶血實(shí)驗(yàn)考察了制劑靜脈注射安全性,結(jié)果證明該制劑無(wú)體內(nèi)溶血性,可用于靜脈注射。在808 nm激光照射下ICG NPs具有良好的光熱轉(zhuǎn)換效率。在相同功率的激光照射下,相同的藥物濃度下,ICG NPs的升溫要高于游離的ICG,質(zhì)量濃度在5~40 μg·mL-1,?T隨濃度的增加先增加后下降,這可能是因?yàn)镮CG濃度過(guò)大,納米粒對(duì)ICG的分散減小,ICG因?yàn)榉肿泳奂l(fā)生熒光猝滅,影響光熱效能;2 W·cm-2照射下ICG NPs升溫到Tmax所用時(shí)間明顯短于游離ICG,可能是納米粒的包載阻礙了熱量的擴(kuò)散,使得局部溫度短時(shí)間內(nèi)快速上升并保持較長(zhǎng)時(shí)間,這表明納米粒的包載提高了ICG的光學(xué)穩(wěn)定性和光熱轉(zhuǎn)化效率。