李德恒, 陸晶芳, 曾金林, 尹丹韓, 李高天

(1. 海南西部中心醫(yī)院,海南 儋州 571700； 2. 杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院,浙江 杭州 310022)

1 引 言

測(cè)量不確定度是表征測(cè)量結(jié)果可用性的重要指標(biāo),不確定度值的大小決定了測(cè)量結(jié)果的可用性[1]。因此,一份完整的測(cè)量結(jié)果必須附有不確定度說(shuō)明才有意義。利巴韋林是一種嘌呤核苷類似物,能抑制多種核酸病毒引起的疾病。該類藥物曾廣泛應(yīng)用于治療動(dòng)物病毒性傳染病,如雞痘、雞傳染性喉氣管炎等[2]。但利巴韋林具有一定的遺傳、生殖毒性和致癌性,禽畜濫用可能會(huì)導(dǎo)致藥物殘留,使其通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體從而影響人體健康[3,4]。

雞蛋是人類經(jīng)常食用的一種動(dòng)物源食品,其含有最適宜人體吸收的蛋白質(zhì),價(jià)格相對(duì)較親民,是補(bǔ)充優(yōu)質(zhì)蛋白的第一選擇,市場(chǎng)需求量極大[5]?，F(xiàn)代蛋雞養(yǎng)殖方式多為大規(guī)模、集中性養(yǎng)殖,因其飼養(yǎng)周期長(zhǎng)、養(yǎng)殖密度大, 且飼養(yǎng)環(huán)境不易通風(fēng)， 導(dǎo)致蛋雞在養(yǎng)殖過(guò)程中極易發(fā)生各種疾病,而一只雞發(fā)病,會(huì)迅速傳染給其他雞,造成養(yǎng)殖場(chǎng)巨大損失。因此,養(yǎng)殖場(chǎng)會(huì)大量使用抗生素,來(lái)預(yù)防及治療疾病,有時(shí)抗微生物藥還以促生長(zhǎng)的目的被違規(guī)使用,這些都極易造成雞體內(nèi)的藥物殘留[6],而這些殘留也會(huì)轉(zhuǎn)移至雞蛋、雞肉等相關(guān)產(chǎn)品中。雞蛋中的藥物殘留比之其他動(dòng)物源性產(chǎn)品引發(fā)的問(wèn)題要更嚴(yán)重,因?yàn)殡u蛋在雞體內(nèi)形成要經(jīng)歷數(shù)天時(shí)間,形成雞蛋的一些成分在雞體內(nèi)或許已存在數(shù)月之久; 因此,雞蛋內(nèi)的藥物殘留往往最難消除[7]。

雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留檢測(cè)一般先用酸性磷酸酶水解,將生物體內(nèi)利巴韋林代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為利巴韋林再進(jìn)行檢測(cè)。目前主要的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)等[8～11],國(guó)家也制定了相應(yīng)的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)；但對(duì)其測(cè)量不確定度尚未作明確規(guī)定[12],國(guó)內(nèi)也無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[13～16],以已添加利巴韋林的陽(yáng)性雞蛋樣品為例,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留量的測(cè)量不確定度進(jìn)行分析評(píng)定,計(jì)算各不確定度分量在整體不確定度中的貢獻(xiàn),為實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行指導(dǎo)；以此保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和可信度,同時(shí)也為其他獸藥殘留測(cè)定結(jié)果的不確定度評(píng)定提供參考。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑、儀器及材料

乙酸銨、三氯乙酸、氨水：分析純,華東醫(yī)藥股份有限公司；甲酸、甲醇、乙腈：色譜純,美國(guó)天地(TEDIA)試劑公司；酸性磷酸酯酶：活力≥0.4 unit/mg,美國(guó)SIGMA公司；超高效液相色譜-串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用：AB SCIEX Qtrap 4000,美國(guó)AB公司,配島津LC-30AD超高效液相色譜儀；超聲波清洗機(jī)：型號(hào)KQ3200V,昆山超聲儀器有限公司；電子分析天平：ME204E及MS105型,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Mill-Q純水儀：美國(guó)Milipore公司；苯硼酸基弱陽(yáng)離子(PBA)固相萃取小柱：美國(guó)Agilent公司；雞蛋：市售抽檢樣品；利巴韋林(批號(hào):G154277),含量：99.3%,德國(guó)DR公司；13C5利巴韋林(批號(hào)：10-MRS-156-1): 含量99.4%,加拿大TRC公司。

2.2 檢測(cè)方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取利巴韋林和13C5利巴韋林內(nèi)標(biāo)10 mg(精確至0.1 mg),用甲醇溶解定容至100 mL容量瓶中, 配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液; 準(zhǔn)確吸取利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5 mL置100 mL容量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,配成0.5 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液；準(zhǔn)確吸取13C5利巴韋林內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1 mL置100 mL容量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,配成0.1 μg/mL內(nèi)標(biāo)工作液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)中間液0.1，0.2，1.0，5.0，10.0 mL,13C5利巴韋林內(nèi)標(biāo)工作液2.0 mL,用乙腈定容至100 mL,得到利巴韋林濃度為1.0, 2.0, 10.0, 50.0, 100.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,內(nèi)標(biāo)濃度為2.0 μg/L。

2.2.2 樣品前處理

取樣品雞蛋,將蛋清與蛋黃攪拌均勻,稱取約5 g(精確至0.01 g)均勻試樣,置于50 mL離心管中,添加0.1 mL內(nèi)標(biāo)工作液,加入12 mL三氯乙酸溶液(20 g/L, pH4.8)和2.5 mL乙腈,振蕩混勻后超聲10 min,10000 r/min離心5 min,取出上清液；再加入10 mL三氯乙酸溶液重復(fù)提取一次,離心后合并上清液定容至25 mL的容量瓶中。準(zhǔn)確移取5 mL提取液,加入1.0 mL乙酸銨溶液(2.0 mol/L,pH4.8),混勻；加入0.1 mL酸性磷酸酯酶(100 μg/mL),旋渦1 min,于37 ℃培養(yǎng)2 h,取出后用氨水調(diào)pH至8.5(±0.1),混勻,離心；取上清液凈化,嚴(yán)格按照PBA固相萃取小柱活化柱子,上樣,依次用5 mL含有10%乙腈-乙酸銨(0.25 mol/L,pH8.5)緩沖液和2.0 mL 5%氨化甲醇淋洗；然后真空抽干5 min,以4.0 mL洗脫液(甲酸-水-甲醇體積比為2:8:90溶液)洗脫至10 mL玻璃管中,氮吹干；準(zhǔn)確加入1.0 mL乙腈-水(體積比90:10)溶液溶解殘?jiān)?過(guò)0.22 μm濾膜,待LC-MS/MS測(cè)定。

2.2.3 色譜質(zhì)譜條件

流動(dòng)相：A為5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.2%甲酸)，B為乙腈；洗脫梯度：0～2 min (5%A)，2～4 min (5%A～30%A)，4～5 min (30%A～60%A)，5～5.1 min (60%A～5%A)，5.1～10 min (5%A～5%A)；色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BHE HILIC (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm)；柱溫：30 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；電離電壓：5.5 kV；源溫：500 ℃；霧化氣壓(GS1)：55 PSI(1 PSI=6.895 kPa)；輔助氣壓(GS2)：55 PSI(1 PSI=6.895 kPa),利巴韋林和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件詳見表1。

表1 利巴韋林的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 Parameters for multi-reaction monitoring of ribavirin

2.2.4 數(shù)學(xué)模型

雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留量按下式計(jì)算：

式中：X為樣品中利巴韋林及其代謝物總殘留量,μg/kg；C為樣品溶液中利巴韋林的含量,μg/L；V為樣品定容體積,mL；m為樣品的取樣量,g；f為稀釋倍數(shù)。

注：*為定量離子。

3 結(jié)果與分析qqq

3.1 不確定度來(lái)源分析

從測(cè)量過(guò)程和數(shù)學(xué)模型分析,雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留量不確定度的因素有：測(cè)量的重復(fù)性引入的不確定度、回收率產(chǎn)生的不確定度、樣品稱量引入的不確定度、樣品前處理稀釋和定容引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度及儀器測(cè)定等引入的不確定度。將模型中各不確定度分量按照J(rèn)JF1059.1—2012測(cè)量不確定度評(píng)定與表示要求展開[17],雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留量的不確定度因果分析如圖1所示。

圖1 雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留量的不確定度來(lái)源Fig.1 A graphical representation of the source of uncertainty in determination the total residues of ribavirin and its metabolites in eggs

3.2 不確定度分量的評(píng)定

3.2.1 測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度

表2 雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留量重復(fù)測(cè)定結(jié)果Tab.2 Repeatability test results of total residues of ribavirin and its metabolites in eggs

3.2.2 回收率產(chǎn)生的不確定度

稱取陰性樣品6份,分別為5.013,5.011,5.010,5.006,5.009,5.011 g(平均質(zhì)量為5.010 g),貝塞爾公式得出S(RmW)=0.002 37 g。按照10.00 μg/kg的添加水品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),回收率R的測(cè)定結(jié)果分別為98.31%,97.86%,96.95%,97.40%,97.86%,96.49%(平均回收率為97.48%),應(yīng)用貝塞爾公式得出回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差S(Rr)=0.006 70。因此由各分量引入的不確定度及回收率的相對(duì)不確定度計(jì)算如下：

=0.000 193

=10.4×10-3

urel(RmW),urel(RV),urel(Rr)是回收率不確定度的3個(gè)分量。urel(RmW)是回收率測(cè)定時(shí)稱量樣品引入的相對(duì)不確定度，包括了樣品重復(fù)性引入的不確定度和天平引入的不確定度urel(mT1) ，其中urel(mT1)的計(jì)算如表3所示；urel(RV)是回收率測(cè)定時(shí)6個(gè)平行樣品最終上機(jī)定容引入的相對(duì)不確定度，定容使用了1 mL移液管吸取定溶液溶解氮吹后的殘?jiān)?，其?jì)算引用了表4中1 mL移液管的數(shù)值；urel(Rr)是回收率測(cè)定時(shí)重復(fù)次數(shù)引入的不確定度，其計(jì)算引用了回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3.2.3 樣品稱量引入的不確定度

由天平引入的不確定度：根據(jù)檢定證書,影響其不確定度的主要因素有于重復(fù)性、示值誤差、分辨力、偏載誤差。按均勻分布處理,其數(shù)值具體見表3。

表3 天平1(d=0.1 mg)稱量引入的不確定度Tab.3 Standard uncertainty of balance

其合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

=0.501 mg

稱取10份樣品,平均值為5.013 g,由重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

綜上,樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

=0.221×10-3

3.2.4 樣品前處理稀釋和定容過(guò)程引入的不確定度

樣品前處理稀釋和定容過(guò)程使用玻璃量器其準(zhǔn)確度等級(jí)為A級(jí),依據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器》規(guī)定的偏差要求[18],玻璃量器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如表4所示。樣品稀釋和定容過(guò)程影響定量的步驟有添加內(nèi)標(biāo),上清液定容,提取液的移取以及上機(jī)定溶液的加入,玻璃量器使用情況統(tǒng)計(jì)如下：25 mL容量瓶一次,5 mL移液管一次,1 mL移液管兩次,設(shè)實(shí)驗(yàn)時(shí)溫差為±5 ℃,按均勻分布處理,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表4 玻璃量器引入的不確定度Tab.4 Uncertainty of glass conainer

=6.12×10-3。

3.2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作溶液配制的不確定度主要來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)品的純度、標(biāo)準(zhǔn)品的稱量、標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋定容等3個(gè)方面。

(1)標(biāo)準(zhǔn)品純度

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品證書,可知利巴韋林純度誤差為±0.2%,按均勻分布處理,則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(2)標(biāo)準(zhǔn)品稱量

采用十萬(wàn)分之一天平,根據(jù)檢定證書,影響其不確定度的主要因素有重復(fù)性、示值誤差、分辨力、偏載誤差。按均勻分布處理,其數(shù)值具體如表5所示。

表5 天平2(d=0.01 mg)稱量引入的不確定度Tab.5 Standard uncertainty of balance

天平稱量引入的不確定度為：

=0.067 8 mg

標(biāo)準(zhǔn)品稱量采用減量法,利巴韋林2次稱取數(shù)值分別為38.12, 28.09 mg,按均勻分布處理,則利巴韋林的相對(duì)不確定度為：

=0.003

(3)標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋和定容

標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋和定容過(guò)程使用玻璃量器其準(zhǔn)確度等級(jí)為A級(jí),依據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器》規(guī)定的偏差要求[18],玻璃量器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如表4所示。標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋和定容過(guò)程使用100 mL容量瓶9次,10 mL移液管1次,5 mL移液管1次,1 mL移液管5次,設(shè)實(shí)驗(yàn)時(shí)溫差為±5 ℃,按均勻分布處理,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(STD3)

=9.73×10-3

綜上,標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作溶液配制過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

=10.2×10-3

3.2.6 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合導(dǎo)致的不確定度

取5個(gè)不同濃度級(jí)別的含有內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定,擬合而成的線性回歸方程為Y=AX+B(B為截距,A為斜率),測(cè)定數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果如表6 所示。則由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合所產(chǎn)生的不確定度為：

表6 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果Tab.6 Results of standard curve

式中：SR為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差,

=0.339 781 μg/kg,

計(jì)算得

3.2.7 儀器測(cè)定引入的不確定度

查詢校準(zhǔn)證書可知,AB SCIEX Qtrap 4000液質(zhì)聯(lián)用儀的峰面積重復(fù)性為0.7%,則其相對(duì)擴(kuò)展不確定度為0.7%,按均勻分布計(jì)算,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3 不確定度各分量匯總

對(duì)以上分析各不確定度分量進(jìn)行匯總,具體見表7。

表7 不確定度各分量匯總Tab.7 Summary of uncertainty components

3.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算如下：

urel(V)2+urel(STD)2+urel(S)2+

4 結(jié) 論

本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋中利巴韋林及其代謝物總殘留的含量,參照CNAS-GL06-2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[19],對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各分量不確定度進(jìn)行分析。根據(jù)各分量不確定度的計(jì)算結(jié)果可知,影響測(cè)量結(jié)果不確定度的主要因素有測(cè)量的重復(fù)性、回收率、樣品的稱量、樣品前處理稀釋和定容、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合及儀器測(cè)定引入。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和標(biāo)準(zhǔn)溶液配置引入的不確定度分量占分別比為55.87%,14.04%。因此在今后實(shí)際樣品檢測(cè)工作中要尤其關(guān)注標(biāo)準(zhǔn)溶液的相關(guān)操作過(guò)程,通過(guò)增加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱樣量、使用準(zhǔn)確度更高的量器、增加標(biāo)準(zhǔn)系列儲(chǔ)備液的測(cè)定次數(shù)、合理確定標(biāo)準(zhǔn)溶液的區(qū)間范圍等措施來(lái)降低檢測(cè)結(jié)果的不確定度。其次是針對(duì)樣品前處理過(guò)程引入的不確定度問(wèn)題,應(yīng)該加強(qiáng)操作人員的熟練度,確保人員操作得規(guī)范性和一致性,盡量提高測(cè)量回收率等措施,以此減少測(cè)量不確定度,從而保證測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。另外本研究檢測(cè)的是蛋黃和蛋清混勻后的試樣檢測(cè),后續(xù)還可以分別探討蛋白和蛋清中各自的利巴韋林殘留量,為進(jìn)一步研究雞蛋中利巴韋林代謝殘留過(guò)程提供依據(jù)。