劉鑫行, 張殿龍, 張竟月, 孫 斌, 佟 林 趙玉曉, 鐘家棟

(1. 中國(guó)計(jì)量大學(xué), 浙江 杭州 310018; 2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院， 北京 100029)

1 引 言

微小容量的應(yīng)用廣泛,主要應(yīng)用于生物制藥、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、化學(xué)測(cè)試等領(lǐng)域[1,2]。醫(yī)療分析儀的單次試劑常用移液量為100 μL[3],生化測(cè)試中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)通常需要配制50 μL溶液[4,5],各領(lǐng)域需要轉(zhuǎn)移的液體容量已從毫升向微升級(jí)擴(kuò)展[3,5]。微量液體的容量轉(zhuǎn)移要求較高,移液器、進(jìn)樣器等由于體積小、便于攜帶成為主要計(jì)量器具[6]。在長(zhǎng)期使用時(shí),移液器由于彈簧形變等原因,容量失準(zhǔn)率會(huì)增高[7],所以需要對(duì)移液器進(jìn)行定期校準(zhǔn)。目前用于液體容積檢測(cè)方法主要分為2類：重力法和非重力法。

重力法采用高精度的電子天平,是目前使用最多的方法。我國(guó)現(xiàn)今用于計(jì)量檢定的方法也是基于重力法,該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求高,很難實(shí)現(xiàn)在線測(cè)量,且高精度的電子天平價(jià)格昂貴。非重力法主要有光學(xué)法和滴定法等[8],滴定法是基于化學(xué)反應(yīng),如沉淀等計(jì)算加入液體的體積[9]。光學(xué)法可分為單波長(zhǎng)測(cè)量和雙波長(zhǎng)測(cè)量,對(duì)環(huán)境要求不高,可實(shí)現(xiàn)在線測(cè)量。

本文基于時(shí)域分光的模式,結(jié)合雙波長(zhǎng)測(cè)量,提出了一種非重力法的微小容量檢測(cè)方法。該方法滿足ISO-8655的技術(shù)要求的同時(shí),可以通過(guò)調(diào)整原液濃度和稀釋比例大大提高實(shí)驗(yàn)效率,與傳統(tǒng)重力法進(jìn)行比較得到了一致的結(jié)論,驗(yàn)證了方法的可行性。

2 微小溶液容積測(cè)量的基本原理

為克服靜力衡量法環(huán)境要求高等問(wèn)題,非重力法是目前研究的趨勢(shì)。光學(xué)法是基于溶液吸光度與溶液濃度的關(guān)系,即當(dāng)一束單色平行光通過(guò)某溶液時(shí),該溶液的吸光度A與入射光強(qiáng)I和透射光強(qiáng)I0的比值有關(guān),見(jiàn)式(1)。

(1)

也可以表示為式(2),在一定條件下,吸光度與溶液的濃度c和通過(guò)溶液的光程b成正比,摩爾吸光系數(shù)K為常數(shù)。

A=Kbc

(2)

由式(2)可知,當(dāng)摩爾吸光系數(shù)K和光程b一定時(shí),吸光度僅與溶液的濃度有關(guān)。但在實(shí)際操作過(guò)程中,在使用分光光度法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí),不同的比色皿之間測(cè)得的吸光度并不一致,用單波長(zhǎng)來(lái)測(cè)量溶液的體積很難避免加工帶來(lái)的光程誤差,所以用分光光度法進(jìn)行容積檢測(cè)時(shí)可選擇雙波長(zhǎng)測(cè)量方法[10]。

2.1 雙波長(zhǎng)測(cè)量原理

雙波長(zhǎng)測(cè)量時(shí)所用的2種液體要求被測(cè)原液在波長(zhǎng)1處有吸收峰,稀釋液在波長(zhǎng)2處有吸收峰且在波長(zhǎng)1處沒(méi)有吸光度或吸光度接近0。被測(cè)原液體積的測(cè)量過(guò)程分為3步。

1) 標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度測(cè)試：分別測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)液在波長(zhǎng)520和730 nm處的吸光度AS1及AS2,標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度也可由式(3)獲得：

(3)

式中：R為標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋比例,VS1和VS2分別為標(biāo)準(zhǔn)液中原液和稀釋液的體積；K1和K2分別為標(biāo)準(zhǔn)液中原液和吸釋液的摩爾吸光系數(shù)；b1，b2為光透過(guò)溶液的光程；c1，c2分別為原液和稀釋液的濃度。

2) 稀釋液的吸光度測(cè)試：在同樣2個(gè)波長(zhǎng)處對(duì)已知體積VD的稀釋液進(jìn)行吸光度測(cè)試,得到吸光度AD1和AD2,對(duì)2個(gè)吸光度做差去除背景噪聲建立零點(diǎn),表達(dá)式見(jiàn)式(4)：

AD2-AD1=K2b2c2

(4)

3) 混合液吸光度測(cè)試：用移液器將體積為VU的原液加至步驟2)中的稀釋液,混合均勻后測(cè)量波長(zhǎng)520 nm處的吸光度AU,同理去除背景噪聲后的表達(dá)式由式(5)表示:

(5)

聯(lián)立式(3)、式(4)和式(5),可得被測(cè)原液的體積VU如式(6)所示。

(6)

通過(guò)上述比值計(jì)算可以將比色皿的加工帶來(lái)的誤差大大減小。

JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》中要求對(duì)微小容量校準(zhǔn)時(shí)需要校準(zhǔn)3個(gè)測(cè)量點(diǎn),每個(gè)測(cè)量點(diǎn)需要測(cè)量6次,若用光學(xué)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),校準(zhǔn)1支移液器就需要18個(gè)比色皿。

由于比色皿是一種較高精度的光學(xué)元件,校準(zhǔn)時(shí)使用的比色皿需經(jīng)常更換。為此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)溶液濃度進(jìn)行調(diào)整,保證溶液的吸光度在線性范圍內(nèi)盡可能多次試驗(yàn),提高比色皿的使用率。

以50 μL原液為例。由于實(shí)驗(yàn)中稀釋液的體積VD已知,每次加入的原液體積一定,則混合液中兩者的比例確定,由式(7)可知溶液的吸光度比值等于稀釋比例的比值,式(7)中A1、A2和R1、R2分別為稀釋前后溶液的吸光度和稀釋比例，K為溶液的摩爾吸光系數(shù)，c為溶液的濃度，l為比色皿的寬度。若要保證溶液的吸光度多次在0.2～0.8內(nèi),按稀釋比例間的比值可以獲得第i次的理論吸光度Ai,經(jīng)過(guò)計(jì)算每個(gè)比色皿最多可用3次,每次加入的原液體積由式(9)計(jì)算,其中AUi+1為第i+1次加入原液后的吸光度,Vi+1為第i+1次加入原液后的總體積,Vi為第i次的總體積。如令第一次加入原液后的吸光度A1為0.25,則A3的理論值就為0.72,A1已知可以由式(8)確定溶液的濃度。

(7)

(8)

(9)

2.2 時(shí)域分光原理

雙波長(zhǎng)測(cè)量時(shí)需要系統(tǒng)進(jìn)行分光處理獲得2種波長(zhǎng),系統(tǒng)的分光原理主要有時(shí)域分光和空域分光2種形式。與空域分光不同,時(shí)域分光是在時(shí)間域上分光,即復(fù)色光源在通過(guò)吸收池前先由分光系統(tǒng)進(jìn)行前分光得到單色光,然后將單色光入射到被測(cè)樣品，根據(jù)溶液在該單色光下的吸光度可以計(jì)算出溶液體積,可以計(jì)算出溶液的體積?？沼蚍止庖部煞Q為后分光,即光源在進(jìn)入樣品室后再由分光系統(tǒng)分光,該方法可以在同一時(shí)刻得到各個(gè)波長(zhǎng)的單色光,實(shí)現(xiàn)空間上的波長(zhǎng)分離。與空域分光系統(tǒng)相比,時(shí)域分光系統(tǒng)對(duì)光源的穩(wěn)定性要求較高,但光路和信號(hào)處理方式較為簡(jiǎn)單,探測(cè)器一般選用光電二極管、光電倍增管等[10～12]。

分光元件是分光系統(tǒng)中主要的元件,常用的有棱鏡和光柵2種[13]。棱鏡分光原理是因?yàn)椴煌ㄩL(zhǎng)的光在同一介質(zhì)中折射率不同,可將復(fù)色光源分成不同波段的光譜[14]；光柵是由大量等寬等間距的平行狹縫組成的光學(xué)元件,每個(gè)狹縫都可以發(fā)生多縫衍射形成色散。

衡量分光元件的色散本領(lǐng)通常以角色散率和線色散率表示。從棱鏡和光柵的色散公式可知,棱鏡對(duì)短波長(zhǎng)的色散能力更強(qiáng),但棱鏡色散的非線性會(huì)大大增加光譜定標(biāo)的難度。

反射光柵的色散能力與光柵常數(shù)、光譜級(jí)次和入射角有關(guān),由于光柵常數(shù)普遍較小,光柵的色散能力較強(qiáng)。從波長(zhǎng)分辨率分析,棱鏡的波長(zhǎng)分辨率與材料色散率和自身尺寸有關(guān),在光譜分析時(shí)可以選用底邊寬度較寬的棱鏡來(lái)提高波長(zhǎng)分辨率[14,15]；光柵光譜的波長(zhǎng)分辨率可由式(10)表示：

(10)

式中:λ為波長(zhǎng);Δλ光譜寬度。

增加光柵的狹縫數(shù)N可以提高光柵分辨率。棱鏡和光柵雖均可用于光譜分析,但光柵刻痕可以很多(即N可以很大),所以與棱鏡相比光柵光譜更精細(xì),波長(zhǎng)分辨率也更高[15，16]。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙波長(zhǎng)測(cè)量減小了由比色皿的加工誤差帶來(lái)的影響,調(diào)整原液濃度實(shí)現(xiàn)多次測(cè)量,提高耗材利用率,并選用光柵作為分光元件設(shè)計(jì)了一套基于時(shí)域分光法的微小容量檢測(cè)系統(tǒng)。

3 實(shí)驗(yàn)與數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)采用時(shí)域分光的原理進(jìn)行微小容量檢測(cè),其測(cè)量原理如圖1所示。

圖1所示系統(tǒng)的分光方式屬于前分光,光源從入射狹縫S1進(jìn)入分光系統(tǒng),經(jīng)凹面鏡M2反射至光柵G,由光柵分光處理后從反射鏡M3和M4反射至出射狹縫S2,然后將單色光入射到樣品室中測(cè)量溶液吸光度,分光系統(tǒng)的操作波長(zhǎng)范圍在300～800 nm,波長(zhǎng)重復(fù)性和準(zhǔn)確性為0.2%,所需波長(zhǎng)可由電機(jī)控制。實(shí)驗(yàn)采用的光源是20 W額定功率鎢燈,圖2是鎢燈光源在520 nm處穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),每隔10 min測(cè)量一次電壓,數(shù)據(jù)顯示光源的穩(wěn)定性小于0.15%,能夠滿足實(shí)驗(yàn)要求。探測(cè)器采用的是光電二極管,該探測(cè)器具有靈敏度高、噪聲小的特點(diǎn),能夠探測(cè)微弱信號(hào)。

圖1 測(cè)量原理圖Fig.1 Basic structure of the system

圖2 光源穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Fig.2 Experiment of light source stability

將1支已校準(zhǔn)的100 μL定點(diǎn)移液器按照上述測(cè)量過(guò)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖3所示,根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算所得的容量允許誤差E和重復(fù)性S如表1所示,結(jié)果顯示通過(guò)時(shí)域分光原理所得的溶液容量的允許誤差和重復(fù)性均在規(guī)程規(guī)定的范圍內(nèi),檢定的結(jié)果與傳統(tǒng)重力法一致。

圖3 100 μL測(cè)量點(diǎn)光學(xué)法和重力法對(duì)比實(shí)驗(yàn)Fig.3 Comparative experiment of optical method and gravity method at 100 μL measuring point

表1 光學(xué)法和重力法在100 μL測(cè)量點(diǎn)的 相對(duì)誤差和重復(fù)性Tab.1 Relative error and repeatability of optical method and gravity method at 100 μL measuring point (%)

同理配制50 μL測(cè)量點(diǎn)多次實(shí)驗(yàn)的原液濃度,取已檢定的移液器在比色皿中重復(fù)做3次試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖4所示,根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算所得的容量允許誤差E和重復(fù)性S如表2所示,數(shù)據(jù)顯示通過(guò)調(diào)整原液濃度可實(shí)現(xiàn)比色皿的重復(fù)使用,且容量的偏差和重復(fù)性均在規(guī)程的允差范圍內(nèi)。

圖4 50 μL測(cè)量點(diǎn)光學(xué)法和重力法對(duì)比實(shí)驗(yàn)Fig.4 Comparative experiment of optical method and gravity method at 50 μL measuring point

表2 光學(xué)法和重力法在50 μL測(cè)量點(diǎn)的 相對(duì)誤差和重復(fù)性Tab.2 Relative error and repeatability of optical method and gravity method at 50 μL measuring point (%)

4 結(jié) 論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得出以下結(jié)論：

1) 使用時(shí)域分光法對(duì)微小溶液進(jìn)行測(cè)量，能夠計(jì)算出待測(cè)溶液的體積,在100 μL測(cè)量時(shí)光學(xué)法測(cè)得的容積為99.67 μL,重復(fù)性為0.35%,所得容量的允許誤差和重復(fù)性滿足要求,為微小溶液容量計(jì)量提供了一種新的方法；

2) 本實(shí)驗(yàn)對(duì)溶液的濃度進(jìn)行調(diào)整,驗(yàn)證了在吸光度的線性范圍內(nèi)比色皿能夠重復(fù)使用得到溶液的體積,在50 μL測(cè)量實(shí)驗(yàn)中測(cè)得容積為50.11 μL,重復(fù)性為1.22%。與傳統(tǒng)重力方法的檢定結(jié)果一致；本實(shí)驗(yàn)對(duì)每一個(gè)測(cè)量點(diǎn)均可以進(jìn)行溶液濃度調(diào)整,在保證吸光度線性范圍內(nèi)可實(shí)現(xiàn)多次測(cè)量；

3) 基于時(shí)域分光原理所得溶液體積的方法與傳統(tǒng)的重力法相比,對(duì)實(shí)驗(yàn)的環(huán)境要求不高,可實(shí)現(xiàn)在線測(cè)量。