趙 曼，祁 智

(1.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，牧草與特色作物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

羊草(Leymuschinensis)別稱堿草，廣泛分布于36°～62° N、92°～132° E，是一種生態(tài)幅度寬廣的旱中型植物[1]，具有抗逆性強(qiáng)、粗蛋白含量高、產(chǎn)量高等優(yōu)良特性，在改善我國北方草原生態(tài)環(huán)境、發(fā)展草原畜牧業(yè)方面發(fā)揮著重要作用[2]。通常情況下，生長在天然草原的羊草經(jīng)常面臨極端氣溫、土壤養(yǎng)分貧瘠和鹽堿脅迫的挑戰(zhàn)。目前，已有學(xué)者從生理學(xué)層面對羊草如何響應(yīng)逆境脅迫進(jìn)行了研究。通常情況下，逆境脅迫時(shí)羊草的發(fā)芽率下降，株高、葉面積、地上生物量等生長指標(biāo)受到顯著抑制[3]；葉片氣孔阻力增大，光合效率與蒸騰速率減弱[4]；無機(jī)離子含量發(fā)生明顯變化[5]，多種酶活性受到抑制[6]。通過提高空氣中CO2濃度[7]，施用適當(dāng)濃度的油菜素內(nèi)酯、5-氨基乙酰丙酸等植物生長調(diào)節(jié)劑或氮、磷、鉀等葉面營養(yǎng)[8-10]有助于羊草體內(nèi)脯氨酸(Proline，Pro)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、有機(jī)酸的合成[11-12]以及超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性的增強(qiáng)[13-14]，能夠有效緩解逆境脅迫對羊草生長帶來的危害。另一方面，隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，羊草的基因組學(xué)研究也逐漸開展，學(xué)者們開始深入到分子生物學(xué)層面探討羊草的抗逆性機(jī)制，尤其是在優(yōu)良抗逆性基因的挖掘方面已取得重要成果。目前已在羊草體內(nèi)鑒定到的抗逆基因很多，如抗鹽脅迫基因LcLHP[15]，抗鹽堿的鐵蛋白基因FER[16]、Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHX1[17]，抗低溫的葉綠體基因FIN2[18]以及抗旱基因WRKY5[19]等。

鈣是植物生長發(fā)育必需的礦質(zhì)元素，一方面Ca2+參與維持細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[20]；另一方面Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，參與多種生理生化過程及酶活性的調(diào)節(jié)[21-22]。近年來，鈣對植物抗逆性的影響研究備受關(guān)注。加入外源鈣能在一定程度上緩解脅迫對植物的傷害[23]，這一方法已廣泛應(yīng)用于小麥[24]、燕麥[25]、苜蓿[26]等植物的抗逆性研究中，但是關(guān)于鈣是否能幫助提高羊草抗逆性的生理研究還較為匱乏，因此，基于無菌培養(yǎng)皿體系，通過模擬鹽、堿、滲透、低溫脅迫并向培養(yǎng)基中加入不同濃度的CaCl2溶液，對CaCl2在羊草應(yīng)對4種非生物脅迫時(shí)的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了分析，可為提高羊草耐受性提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

羊草種子于2018年9月采自內(nèi)蒙古呼和浩特市和林格爾縣，地理坐標(biāo)為40°31′32.47″N，111°50′33.22″E?，F(xiàn)保存于牧草與特色作物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 全營養(yǎng)培養(yǎng)基(CK)的配制：以1 L為例，0.5 mol/L MES 10 mL，100×MS Fe鹽5 mL，1 mol/L H3PO41 mL，1 mol/L CaCl21 mL，1 mol/L MgSO41 mL，100×MS MnSO45 mL，200×MS微量元素2.5 mL，1 mol/L KNO35 mL，BTP調(diào)節(jié)溶液pH值至5.7，加入1%蔗糖與1.1%瓊脂。121 ℃高溫高壓滅菌20 min，倒入10 cm×10 cm的方形塑料培養(yǎng)皿中，凝固后備用。

1.2.2 試驗(yàn)處理 在CK的基礎(chǔ)上，通過改變培養(yǎng)基中的NaCl濃度模擬鹽脅迫，改變pH值模擬堿脅迫，改變Mannitol濃度模擬滲透脅迫，改變羊草幼苗的生長溫度模擬低溫脅迫。每種試驗(yàn)處理設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。具體試驗(yàn)處理如下：含不同濃度CaCl2(0，1，20 mmol/L)并含不同濃度NaCl(0，150 mmol/L)；含不同濃度CaCl2(0，1，20 mmol/L)并含不同pH值(5.7，8.5)；含不同濃度CaCl2(0，1，20 mmol/L)并含不同濃度Mannitol(0，300 mmol/L)；含不同濃度CaCl2(0，1，20 mmol/L)并含不同生長溫度(23，4 ℃)。

1.2.3 鈣對鹽、堿、滲透脅迫下羊草幼苗生長特性的影響 將羊草種子浸泡于去離子水中，置于4 ℃冰箱內(nèi)，5 d后挑取已沉底種子，用含有5% NaClO+0.1% Triton X-100的溶液消毒30 min，之后用去離子水清洗6次，備用。消毒后的羊草種子播種在不同試驗(yàn)處理的培養(yǎng)基中，置于生長室內(nèi)黑暗春化2 d后進(jìn)行豎直培養(yǎng)。光照11 d后，觀察表型并拍照，測量根長、葉長、鮮質(zhì)量數(shù)據(jù)。生長室的培養(yǎng)條件為：(22±2)℃，光周期為12 h光照/12 h黑暗，光照強(qiáng)度150 μmol/(m2·s)。

1.2.4 鈣對低溫脅迫下羊草幼苗生長與生理特性的影響 利用RDN-400D-3型人工氣候箱對供試羊草進(jìn)行培養(yǎng)，通過改變氣候箱中的晝/夜溫度模擬低溫脅迫。將消毒后的羊草種子分別播種在3種不同濃度CaCl2的培養(yǎng)基上，置于人工氣候箱內(nèi)(對照組：晝/夜為23 ℃/23 ℃)黑暗春化2 d后，分別放入23 ℃/23 ℃、23 ℃/4 ℃環(huán)境中進(jìn)行豎直培養(yǎng)。光照11 d后，觀察表型，采集根長、葉長、鮮質(zhì)量數(shù)據(jù)，并拍照。同時(shí)利用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒(http：//www.cominbio.com/)對羊草葉中的丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、還原型谷胱甘肽(Reduced glutathione，GSH)、還原型抗壞血酸(Ascorbic acid，AsA)含量及超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)、谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase，GR)酶活性進(jìn)行測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Dunnett法比較不同處理間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣對鹽脅迫下羊草種子發(fā)芽率和幼苗生長特性的影響

2.1.1 鈣對鹽脅迫下羊草種子發(fā)芽率的影響 由圖1可知，與0 mmol/L NaCl相比，相同CaCl2濃度下150 mmol/L NaCl脅迫會顯著抑制羊草種子萌發(fā)(P<0.05)。0 mmol/L NaCl條件下，3種不同濃度CaCl2的培養(yǎng)基上，羊草種子的發(fā)芽率為96.23%～99.04%，不同處理間的差異不顯著(P>0.05)。150 mmol/L NaCl脅迫時(shí)，當(dāng)補(bǔ)加CaCl2濃度由0 mmol/L增加至1～20 mmol/L時(shí)，羊草種子的發(fā)芽率由28.57%提高至85.00%，當(dāng)補(bǔ)加1 mmol/L CaCl2后羊草種子發(fā)芽率顯著提高。

2.1.2 鈣對鹽脅迫下羊草幼苗生長特性的影響 由圖2可知，與0 mmol/L NaCl相比，相同CaCl2濃度下150 mmol/L NaCl脅迫時(shí)羊草幼苗的根長、葉長和鮮質(zhì)量都顯著降低(P<0.05)，其中根長降低18.87%～25.49%，葉長降低47.18%～51.18%，鮮質(zhì)量降低50.32%～74.47%。由此可見，150 mmol/L NaCl脅迫時(shí)羊草幼苗的生長受到抑制。0 mmol/L NaCl條件下，3種不同濃度CaCl2的培養(yǎng)基上，羊草幼苗的根長、葉長和鮮質(zhì)量均無顯著差異(P>0.05)。150 mmol/L NaCl脅迫時(shí)，當(dāng)外源CaCl2濃度為0 mmol/L時(shí)，羊草幼苗的生長受到顯著抑制，羊草幼苗的根長、葉長數(shù)據(jù)無法準(zhǔn)確采集，只采集到其鮮質(zhì)量數(shù)據(jù)；當(dāng)外源CaCl2濃度增加至1 mmol/L時(shí)，羊草幼苗的根長、葉長和鮮質(zhì)量顯著增加(P<0.05)，其中鮮質(zhì)量增加了90.36%。當(dāng)外源CaCl2濃度由1 mmol/L增加至20 mmol/L時(shí)，羊草幼苗的根長、葉長和鮮質(zhì)量均無顯著性差異(P>0.05)。綜上所述，補(bǔ)加1 mmol/L外源CaCl2能有效緩解150 mmol/L NaCl脅迫對羊草幼苗生長的抑制作用。

為了與一般納稅人增值稅納稅申報(bào)表相銜接，以“應(yīng)納稅額”專欄替代原來的“轉(zhuǎn)出未交增值稅”、“轉(zhuǎn)出多交增值稅”專欄，用以結(jié)轉(zhuǎn)計(jì)算一般計(jì)稅當(dāng)月應(yīng)納增值稅。

2.2 鈣對堿脅迫下羊草幼苗生長特性的影響

由圖3可知，與pH值5.7相比，相同CaCl2濃度下pH值8.5脅迫時(shí)羊草幼苗的根長、葉長、鮮質(zhì)量基本都降低，其中根長降低10.71%～20.35%，葉長降低40.84%～47.84%，鮮質(zhì)量降低43.15%～47.69%。結(jié)果表明，pH值8.5脅迫時(shí)羊草幼苗的生長受到抑制。pH值5.7條件下，3種不同濃度CaCl2的培養(yǎng)基上，羊草幼苗的根長、葉長和鮮質(zhì)量均無顯著性差異(P>0.05)。pH值8.5脅迫時(shí)，3種不同濃度CaCl2的培養(yǎng)基上，羊草幼苗的葉長和鮮質(zhì)量均無顯著性差異(P>0.05)。當(dāng)培養(yǎng)基中CaCl2濃度由0 mmol/L增加至1 mmol/L時(shí)，羊草幼苗的根長增加14.94%；當(dāng)CaCl2濃度由1 mmol/L增加至20 mmol/L時(shí)，羊草幼苗的根長下降10.00%。總的來說，補(bǔ)加外源CaCl2并未有效緩解pH值8.5脅迫對羊草幼苗生長的抑制作用。

2.3 鈣對滲透脅迫下羊草幼苗生長特性的影響

由圖4可知，與0 mmol/L Mannitol相比，相同CaCl2濃度下300 mmol/L Mannitol脅迫時(shí)羊草幼苗的根長、葉長和鮮質(zhì)量均顯著降低(P<0.05)，其中根長降低27.70%～35.20%，葉長降低47.14%～50.00%，鮮質(zhì)量降低38.35%～41.74%。結(jié)果表明，300 mmol/L Mannitol脅迫時(shí)羊草幼苗的生長受到抑制。0 mmol/L Mannitol條件下，3種不同濃度CaCl2的培養(yǎng)基上，羊草幼苗的根長、葉長和鮮質(zhì)量均無顯著性差異(P>0.05)。300 mmol/L Mannitol脅迫時(shí)，3種不同濃度CaCl2的培養(yǎng)基上，羊草幼苗的根長、葉長和鮮質(zhì)量均無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明，補(bǔ)加外源CaCl2并未有效緩解300 mmol/L Mannitol脅迫對羊草幼苗生長的抑制作用。

2.4 鈣對低溫脅迫下羊草幼苗生長和生理特性的影響

2.4.1 鈣對低溫脅迫下羊草幼苗生長特性的影響 由圖5可知，與對照(23 ℃)相比，相同CaCl2濃度下4 ℃脅迫時(shí)羊草幼苗的葉長、鮮質(zhì)量顯著降低(P<0.05)，其中葉長降低23.72%～49.12%，鮮質(zhì)量降低26.91%～43.35%。當(dāng)CaCl2濃度為0 mmol/L，4 ℃脅迫時(shí)羊草的根長會顯著降低20.19%；當(dāng)CaCl2濃度為1 mmol/L時(shí)，對照和低溫脅迫下羊草的根長差異不顯著(P>0.05)；當(dāng)CaCl2濃度為20 mmol/L，4 ℃脅迫時(shí)羊草的根長會顯著降低20.85%?？偟膩碚f，4 ℃低溫脅迫時(shí)羊草幼苗的生長受到抑制。23 ℃生長條件下，3種不同濃度CaCl2的培養(yǎng)基上，羊草幼苗的根長、葉長和鮮質(zhì)量均無顯著性差異(P>0.05)。4 ℃脅迫時(shí)，當(dāng)外源CaCl2濃度由0 mmol/L增加至1 mmol/L時(shí)，羊草幼苗的根長、葉長與鮮質(zhì)量均顯著增加(P<0.05)，其中根長增加19.88%，葉長增加18.10%，鮮質(zhì)量增加23.25%。當(dāng)CaCl2濃度由1 mmol/L增加至20 mmol/L時(shí)，羊草幼苗的根長會下降16.08%，而葉長與鮮質(zhì)量分別增加了19.71%，11.90%。綜上所述，補(bǔ)加20 mmol/L外源CaCl2能有效緩解4 ℃低溫脅迫對羊草幼苗生長的抑制作用。

2.4.2 鈣對低溫脅迫下羊草的膜脂過氧化物和保護(hù)酶活性的影響 MDA是植物在遭遇逆境脅迫時(shí)膜脂過氧化物作用的產(chǎn)物，其含量大小間接反映了細(xì)胞膜受損程度。由圖6可知，與對照(23 ℃)相比，相同CaCl2濃度下4 ℃脅迫時(shí)羊草葉中MDA含量(以鮮質(zhì)量計(jì))顯著升高(P<0.05)。4 ℃脅迫時(shí)，補(bǔ)加外源CaCl2后羊草葉中MDA含量會顯著下降(P<0.05)。當(dāng)補(bǔ)加CaCl2濃度分別為1，20 mmol/L時(shí)，MDA含量分別降低了27.41%，36.78%，這表明補(bǔ)加外源CaCl2能降低羊草葉中MDA的積累量，有效緩解低溫脅迫對膜的損害。

與對照(23 ℃)相比，當(dāng)CaCl2濃度在0～1 mmol/L時(shí)，4 ℃脅迫對羊草葉中SOD活性(以鮮質(zhì)量計(jì))影響不顯著(P>0.05)；當(dāng)CaCl2濃度為20 mmol/L時(shí)，SOD活性顯著增加11.68%。4 ℃脅迫時(shí)，當(dāng)外源CaCl2濃度由0 mmol/L增加至1～20 mmol/L時(shí)，羊草葉中SOD活性提高至原來的1.73～2.03倍。當(dāng)CaCl2濃度為20 mmol/L時(shí)，羊草葉中SOD活性最高。

與對照(23 ℃)相比，相同CaCl2濃度下4 ℃脅迫時(shí)羊草葉中POD活性(以鮮質(zhì)量計(jì))顯著增強(qiáng)了15.89%～50.58%。4 ℃脅迫時(shí)，補(bǔ)加1 mmol/L CaCl2時(shí)對羊草葉中POD活性無顯著影響，補(bǔ)加20 mmol/L CaCl2時(shí)POD活性顯著增加7.41%～12.60%。

與對照(23 ℃)相比，相同CaCl2濃度下4 ℃脅迫時(shí)羊草葉中CAT活性(以鮮質(zhì)量計(jì))顯著提高至原來的1.02～1.14倍。4 ℃脅迫時(shí)，補(bǔ)加1 mmol/L CaCl2時(shí)對羊草葉中CAT活性無顯著影響，補(bǔ)加20 mmol/L CaCl2時(shí)CAT活性顯著增加12.87%～17.01%。

與對照(23 ℃)相比，相同CaCl2濃度下4 ℃脅迫時(shí)羊草葉中GR活性未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。4 ℃脅迫時(shí)，補(bǔ)加1 mmol/L CaCl2對羊草葉中GR活性無顯著影響，補(bǔ)加20 mmol/L CaCl2時(shí)GR活性顯著增加14.52%～27.95%。

與對照(23 ℃)相比，相同CaCl2濃度下4 ℃脅迫時(shí)羊草葉中GSH含量(以鮮質(zhì)量計(jì))未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。4 ℃脅迫時(shí)，3種不同濃度CaCl2的培養(yǎng)基上，羊草葉中GSH含量均無顯著性差異(P>0.05)。

與對照(23 ℃)相比，相同CaCl2濃度下4 ℃脅迫時(shí)羊草葉中還原型AsA含量(以鮮質(zhì)量計(jì))顯著增加了20.50%～38.94%。4 ℃脅迫時(shí)，補(bǔ)加1 mmol/L CaCl2對羊草葉中還原型AsA含量無顯著影響，補(bǔ)加20 mmol/L CaCl2時(shí)還原型AsA含量顯著增加13.90%～20.31%。

總的來說，低溫脅迫下，補(bǔ)加20 mmol/L CaCl2時(shí)羊草葉中MDA含量降低，SOD、POD、CAT、GR活性增強(qiáng)，還原型AsA含量增加，羊草的抗寒能力明顯提高。

3 討論與結(jié)論

3.1 鈣調(diào)節(jié)羊草非生物脅迫耐受性的作用

本研究發(fā)現(xiàn)，150 mmol/L NaCl脅迫時(shí)羊草種子發(fā)芽率、根長、葉長和鮮質(zhì)量均顯著下降，羊草生長受到抑制。這是因?yàn)楦邼舛鹊腘aCl能置換細(xì)胞膜上的Ca2+，使得膜結(jié)合的Na+/Ca2+增加，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)受到損傷，通透性增加，引起細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)外滲[27]；此外，NaCl脅迫下植物的凈光合速率和蒸騰速率呈下降趨勢[28]，將會影響光合作用、礦質(zhì)元素吸收等生理活動過程，致使植物生長受阻，生物量減少[29-30]。當(dāng)補(bǔ)加外源CaCl2后羊草種子的發(fā)芽率提高，根長、葉長、鮮質(zhì)量增加，表明CaCl2能有效緩解鹽脅迫對羊草幼苗生長的抑制作用，這與Genc等[31]、楊利艷等[32]在研究Ca2+對小麥萌發(fā)及抗鹽性效應(yīng)時(shí)得出的結(jié)果一致，即一定濃度的CaCl2能促進(jìn)種子萌發(fā)、緩解鹽害對幼苗生長的抑制作用。引起該結(jié)果的原因可能是由于補(bǔ)加外源Ca2+后細(xì)胞膜脂組分中的磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PG)、磷脂酰甘油(PA)含量增加，高水平的磷脂可結(jié)合更多的Ca，增大質(zhì)膜磷脂單層的穩(wěn)定性，改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使得Na+、氯化物不易進(jìn)入細(xì)胞[33]，在一定程度上降低質(zhì)膜的透性及膜脂過氧化程度；另外，外源Ca2+的加入能彌補(bǔ)植物自身因Ca2+不足引起的營養(yǎng)脅迫，維持植物體內(nèi)礦質(zhì)元素(K、Ca)的正常代謝吸收[34]。然而當(dāng)補(bǔ)加CaCl2濃度在1～20 mmol/L時(shí)，羊草種子發(fā)芽率、根長、葉長、鮮質(zhì)量沒有發(fā)生顯著變化，說明并非外源Ca2+濃度越高羊草幼苗的抗鹽性越強(qiáng)，這與韓志平等[35]、李春燕等[36]的研究得出的結(jié)論相似。鹽脅迫條件下補(bǔ)加外源CaCl2時(shí)，Ca2+本身會產(chǎn)生鹽脅迫[36]，而Cl-大量累積也會加重鹽脅迫，此時(shí)植物細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量下降，對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性造成損傷[37]，最終導(dǎo)致植物的生長受抑制。

pH值8.5脅迫或300 mmol/L Mannitol脅迫時(shí)，羊草幼苗的根長、葉長和鮮質(zhì)量等生長指標(biāo)均受到顯著影響，但是補(bǔ)加1～20 mmol/L CaCl2后并未有效緩解堿脅迫或滲透脅迫對羊草幼苗生長的抑制作用，這與Chen等[38]、宋新妍等[39]、姜義寶等[40]的類似研究結(jié)果存在差異。Chen等[38]在研究鹽堿脅迫與外源Ca2+交互作用對多花黑麥草生長和滲透調(diào)節(jié)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外源Ca2+濃度為6 mmol/L時(shí)，黑麥草葉片中脯氨酸含量最低，葉綠素含量、根系活力和Mg2+含量最高，植株生長受抑狀況得到顯著改善。宋新妍等[39]在研究鈣處理對小麥抗旱性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，100 mmol/L CaCl2噴施處理小麥苗期葉片能使Pro、可溶性糖含量增加，MDA含量降低，SOD活性升高。姜義寶等[40]在研究鈣處理對苜蓿幼苗抗旱性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，20 mmol/L CaCl2處理能有效提高苜蓿的抗旱性。本研究與以往類似研究結(jié)論不一致的原因可能與外源CaCl2濃度、植物種類、脅迫程度等多個(gè)因素密切相關(guān)。

4 ℃低溫脅迫時(shí)，羊草幼苗的生長受到了抑制，根長、葉長和鮮質(zhì)量顯著下降，這與張燕[41]在研究不同溫度對羊草形態(tài)特征的影響時(shí)得出的結(jié)論一致，即低溫處理會顯著降低羊草的株高、干鮮質(zhì)量、根系活力。補(bǔ)加CaCl2后羊草幼苗在低溫脅迫下的受抑制作用得到顯著緩解，為了深入分析鈣的調(diào)節(jié)作用，對加入CaCl2前后羊草幼苗體內(nèi)的生理指標(biāo)進(jìn)行了測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫時(shí)羊草葉中MDA含量、POD、CAT活性顯著增加，這表明低溫脅迫時(shí)羊草體內(nèi)的活性氧過多積累導(dǎo)致膜脂過氧化，此時(shí)抗氧化系統(tǒng)開始發(fā)揮作用。當(dāng)補(bǔ)加外源CaCl2后羊草葉中MDA含量降低，SOD、POD、CAT、GR活性及還原型AsA含量增加，這與胡麗濤[24]、張麗等[42]、Shi等[43]在研究外源CaCl2在小麥、裸燕麥、百慕達(dá)草應(yīng)對冷脅迫時(shí)所起的調(diào)節(jié)作用結(jié)果一致。Ca2+是植物體內(nèi)的一種信號分子，當(dāng)?shù)蜏孛{迫發(fā)生時(shí)，位于質(zhì)膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ca2+通道打開，此時(shí)細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度將發(fā)生變化，產(chǎn)生鈣信號。Ca2+與受體蛋白CaM結(jié)合形成多功能的調(diào)節(jié)蛋白Ca2+-CaM，調(diào)控Ca2+-ATPase等下游靶蛋白酶的活性，繼而引發(fā)相應(yīng)的生理響應(yīng)以抵御逆境脅迫[24]。

3.2 研究不足之處

生長在自然條件下的羊草常受到極端氣溫、土壤養(yǎng)分貧瘠和鹽堿脅迫的影響，不僅嚴(yán)重?fù)p害了它的產(chǎn)量與品質(zhì)，甚至?xí)璧K畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展。因此，本研究在模擬鹽、堿、滲透和低溫4種非生物脅迫的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)探討了添加外源CaCl2是否有助于提高羊草幼苗的耐受性。然而研究中仍存在些許不足之處：非生物脅迫下，羊草幼苗的生長受到了抑制，但是僅選取了低溫這一因素深入分析了加入CaCl2前后羊草幼苗體內(nèi)多種防御酶的變化。這是因?yàn)棰?50 mmol/L NaCl脅迫下，當(dāng)外源CaCl2為0 mmol/L時(shí)羊草種子的發(fā)芽率極低，幼苗的生長發(fā)育受到顯著抑制，收集到的羊草幼苗無法滿足生理試驗(yàn)測定，因此并未對不同組合處理間羊草體內(nèi)的防御酶進(jìn)行測定。陳全戰(zhàn)等[44]在研究鈣對鹽脅迫下向日葵幼苗光合生理特性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，150 mmol/L NaCl脅迫條件下，經(jīng)過鈣處理后的植物幼苗其體內(nèi)的SOD、POD和CAT活性明顯提高，MDA含量降低，這為本研究“150 mmol/L NaCl脅迫時(shí)加入CaCl2前后羊草幼苗體內(nèi)防御酶的變化”提供了可參考的數(shù)據(jù)。②pH值 8.5或300 mmol/L Mannitol脅迫下，補(bǔ)加外源CaCl2沒有顯著提高羊草幼苗的抗堿性或抗旱性，因此未再進(jìn)一步分析堿、干旱脅迫時(shí)羊草幼苗羊草體內(nèi)防御酶等的變化。今后可在已有的基礎(chǔ)上，通過增設(shè)CaCl2濃度梯度，改變鹽、堿和滲透脅迫程度更細(xì)致探討鈣在羊草應(yīng)對脅迫時(shí)的調(diào)節(jié)作用，為提高羊草適應(yīng)性及其栽培生產(chǎn)和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

3.3 結(jié)論

補(bǔ)加外源 CaCl2可以提高羊草的抗鹽能力和抗低溫能力，但是對羊草的抗堿和抗?jié)B透脅迫能力沒有改善，這表明鈣在羊草應(yīng)對非生物脅迫時(shí)的調(diào)節(jié)作用受到CaCl2濃度、脅迫類型與程度的共同影響。