梅 瑜，李向榮，蔡時可，顧 艷，王繼華

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院 作物研究所，廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.汕尾市陸河縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，廣東 汕尾 516600)

粉葛為豆科植物甘葛藤(Puerariathomsonii)的干燥根[1]，性味甘、辛、涼，具有解肌退熱、生津止渴、升陽止瀉、通經(jīng)活絡、解酒毒等功效[2-3]。粉葛的藥用功能始載于東漢時期的《神農(nóng)本草經(jīng)》及《名醫(yī)別錄》，此外，在古典藥用植物《本草品匯精要》等書籍及現(xiàn)代的《中藥大辭典》和《中國藥典》中都有記載[4]。甘葛藤種質(zhì)資源豐富，在我國主要分布在云南、四川、西藏、江西、海南、廣東、廣西等地，部分地區(qū)還獲得了國家地理標志認證，如廣東的合水粉葛、火山粉葛、竹山粉葛、廟南粉葛、鶴山粉葛和活道粉葛等[5]。作為我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物，其有效藥用物質(zhì)主要集中在根部，包括淀粉類、黃酮類、葛根苷類、香豆素類、三萜類和三萜皂苷類等100多種化合物，花中還鑒定出15種新的化合物[6]。其中，葛根素是功能研究較多的化合物，也稱葛根黃素，是異黃酮類衍生物，在葛根藥用成分中研究相對較多，具有退熱、擴冠狀的作用，在臨床上常用于冠心病心絞痛、高血壓的治療[7]。

粉葛醫(yī)藥保健作用越來越受到人們的重視，開發(fā)出來的產(chǎn)品種類也越來越豐富，開發(fā)前景廣闊，但其研究主要集中在化合物的分離和鑒定方面。轉錄組是基因功能研究的基礎和出發(fā)點，連接基因組遺傳信息與蛋白質(zhì)組。單分子測序技術為第3代測序技術，是近年逐漸成熟的新一代測序技術，在轉錄組學研究方面具有獨到優(yōu)勢。研究非模式植物的功能基因組學時，獲得全長轉錄本可推進基礎研究水平，第3代測序技術為此提供了較好的解決方案[8]。目前，全長轉錄組測序技術已經(jīng)廣泛應用于動植物的研究中，如利用全長轉錄組開發(fā)姜荷花(Curcumaalismatifolia)的分子標記[9]；利用聯(lián)合測序技術研究丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)活性成分的生物合成及調(diào)控機制[10]；利用三代測序PacBio平臺獲得苦苣菜(SonchusoleraceusL.)葉片全長轉錄組參考序列，結合BGISEQ-500平臺的數(shù)字基因表達譜技術，分析不同濃度NaCl處理2 d苦苣菜葉片轉錄組表達譜，探究苦苣菜響應鹽脅迫的主要基因及代謝途徑[11]，目前在粉葛的研究上還未見相關報道。本研究對甘葛藤進行全長轉錄組測序分析和基因注釋，并對轉錄因子(Transcription factor TFs)、R基因和SSR標記進行鑒定，為甘葛藤優(yōu)良品種選育和利用提供幫助。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

一年生的甘葛藤植株取于廣東省廣州市南沙區(qū)廟街。分別采集植株葉片、嫩莖和根，立即在液氮冷凍，存儲于-80 ℃冰箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取 采用植物RNA提取試劑盒(TIANGEN(天根生化科技北京)有限公司，貨號DP441)分別提取甘葛藤3個器官的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的完整性，DNA Marker為全式金B(yǎng)M101(TransGen Biotech)，15 000 bp。使用NanoPhotometer spectrophotometer和安捷倫2100生物分析儀(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)評估RNA質(zhì)量和完整性。選擇3個OD260nm/230nm>1.8的總RNA等量混合，構建文庫，用Pacbio三代測序儀(Pacific Biosciences，US)進行全長轉錄組測序。

1.2.2 建庫測序與拼接組裝 采用PacBio三代測序儀對甘葛藤的cDNA進行測序。檢測合格后的RNA使用ClontechSMARTer PCR cDNA Synthesis Kit反轉錄為第1鏈cDNA；PCR擴增合成雙鏈cDNA；使用AMPure PB Bead對PCR擴增產(chǎn)物進行純化用于SMRTbell文庫構建，包括DNA損傷修復、末端修復、連接Adapter、文庫質(zhì)量評估，將SMRTbell文庫退火結合引物和聚合酶，采用MagBead Loading上機測序，由廣州基迪奧生物技術有限公司完成。利用Fast QC評估原始數(shù)據(jù)，利用NGS QC工具包對數(shù)據(jù)進行過濾(去除含接頭或含N的讀長，大于10%未知核苷酸或大于40%低質(zhì)量堿基的讀長，Q值≤20)，獲得質(zhì)量較高的讀長，然后用Trinily軟件進行轉錄本的拼接組裝[12]。

1.2.3 單基因功能注釋 利用BlastX程序?qū)CBI數(shù)據(jù)庫(Nr)、Swiss Prot蛋白數(shù)據(jù)庫、KEGG和COG/KOG數(shù)據(jù)庫進行比對分析，用Blast2GO軟件分析GO的功能注釋和Nr注釋結果[13]，用WEGO軟件進行功能分類[14]。使用EST掃描軟件確認蛋白質(zhì)編碼序列和序列方向，將單基因的蛋白質(zhì)編碼序列與智能數(shù)據(jù)庫(SMART database)比對(版本號SMART 06/08/2012)，獲得蛋白質(zhì)結構域注釋。

1.2.4 轉錄因子(TFs)和R基因分析 利用BlastP將單基因蛋白編碼序列與植物轉錄因子數(shù)據(jù)庫v4.0(http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)進行比對，預測TF家族；通過BlastP將單基因的蛋白質(zhì)編碼序列與植物R基因數(shù)據(jù)庫PRGdb(http：//PRGdb.crg.eu/wiki/Main_Page)進行比對，預測甘葛藤中的R基因。

1.2.5 SSRs預測 依據(jù)配置參數(shù)使用軟件MISA(http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)對甘葛藤轉錄組Isoform進行搜索，尋找Isoform中的SSR，并用Primer軟件設計SSR側翼區(qū)的引物。

2 結果與分析

2.1 甘葛藤全長轉錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)控

利用單分子長讀數(shù)測序技術(Single-molecule longread sequencing technology, SMRT),總共獲得19 680 274 333 bp，去除低質(zhì)量序列后，獲得10 994 967個高質(zhì)量reads，N50為 2 524 bp，平均長度為1 789 bp。Full Passes數(shù)目大于等于2的序列為參數(shù)，提取reads中的CCS序列得到492 223個reads，共1 177 436 362 bp，平均長度為2 392 bp。其中，含有5′primer的 CCS有444 921條，含有3′primer的CCS 有457 237條，含有polyA的CCS有449 010條。全長reads為416 045條，全長非嵌合序列(Full-length non-chimeric，F(xiàn)LNC)384 072條，占78.03%，共906 989 814 bp，平均長度2 361 bp；其次是非全長序列(Non-full-length reads)占15.29%；全長嵌合體序列(Full-length chimeric)和短序列(Short)占比較少，分別為6.50%，0.19%。

對reads進行聚類和校正，得到193 955條初步校正的一致性序列(Unpolished consensus isoforms)；用Quiver算法對一致性序列進行進一步的校正得到高質(zhì)量序列146 312條，低質(zhì)量46 138條，平均長度2 365 bp。一致性序列進行去冗余得到高質(zhì)量序列90 856條，共218 049 687 bp，最長序列為14 015 bp，最短為131 bp，平均為2 399.95 bp，N50為2 777 bp，GC含量為40.31%。

2.2 甘葛藤全長轉錄組功能注釋

利用公共數(shù)據(jù)庫對90 856個轉錄本進行比對注釋，結果85 239個單基因被NR、Swissprot、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫注釋。其中，84 675個基因被注釋到NR數(shù)據(jù)庫，占93.2%；73 149個基因被注釋到Swissprot數(shù)據(jù)庫，占80.51%；被KOG數(shù)據(jù)庫注釋的基因有59 931個，占65.96%；KEGG數(shù)據(jù)庫注釋的基因有38 460個，占42.33%；未被以上數(shù)據(jù)庫注釋的基因有5 617個，占組裝基因的6.12%，可能是新基因不能被注釋；被四大數(shù)據(jù)庫共同注釋的基因有32 037個。

利用BlastX進行同源序列比對，結果發(fā)現(xiàn)，甘葛藤和大豆(Glycinemax)的單基因匹配率最高，共有39 603個(43.59%)，其次是野大豆(Glycinesoja，12 598個，13.87%)、木豆(Cajanuscajan，10 230個，11.26%)、苜蓿(Medicagotruncatula，4 621個，5.09%)、綠豆(Vignaradiata，3 674個，4.04%)和赤豆(Vignaangularis，3 246個，3.57%)等(表1)。

表1 物種分布統(tǒng)計Tab.1 Statistical table of species distribution

2.2.1 KOG分析 共有59 931個基因被KOG注釋分為25類(圖1)。按照功能來分，大多數(shù)基因?qū)儆谝话愎δ茴A測(20 168；22.20%)，其次是信號轉導機制(15 265；16.80%)和翻譯后修飾、蛋白轉換、伴侶(12 519；13.78%)等。少數(shù)單基因被分配到細胞動力，僅有81個；其次是細胞外結構和核結構，分別為362，445個；另有4 243個基因未知功能。有2 891個基因與次生代謝物生物合成、運輸和分解代謝相關，這些基因可能對甘葛藤中次生代謝物的特定生物合成、運輸和積累有重要作用。

2.2.2 GO 功能注釋分類 30 837個基因被注釋到GO數(shù)據(jù)庫，被分為三大類：生物過程、細胞組分和分子功能。46.93%的基因分布在生物過程，其中代謝過程的基因最多(19 087，21.01%)，其次是細胞過程(17 710，19.49%)、單有機體過程(13 326，14.67%)、生物調(diào)節(jié)(5 678，6.25%)。30.89%的基因分布在細胞組分中，細胞(11 388，12.53%)和細胞部分(11 387，12.53%)是本亞類的最主要的組分，其次為細胞器(9 183，10.11%)、膜(6 139，6.76%)和膜部分(4 559，5.02%)等。22.18%的基因被注釋到分子功能，催化活性(18 249，20.09%)最為突出，其次是結合(15 027，16.54%)、運輸活性(1 516，1.67%)等(圖2)。

2.2.3 KEGG通路分析 通過KEGG數(shù)據(jù)庫比對分析，共有22 330個基因被注釋到132條途徑。其中代謝途徑(9 368，41.95%)分布的基因最多，其次是次級代謝產(chǎn)物生物合成(5 220，23.48%)、抗生素生物合成(2 372，10.62%)、不同環(huán)境的微生物代謝(2 258，10.11%)、碳代謝(1 783，7.98%)、氨基酸生物合成(1 261，5.65%)等(表2)。

表2 KEGG通路富集Tab.2 KEGG pathway enrichment

2.2.4 黃酮類生物合成基因的鑒定 黃酮類是植物的苯丙氨酸代謝過程中產(chǎn)生的植物次生代謝產(chǎn)物，是一類由肉桂酰輔酶A側鏈延長后環(huán)化形成以苯色酮環(huán)為基礎的酚類化合物。異黃酮類物質(zhì)是粉葛的主要活性成分，其中如葛根素、鳶尾苷元和鳶尾苷，是粉葛的主要的藥用成分之一[15]。根據(jù)粉葛的轉錄組數(shù)據(jù)繪制其黃酮類生物合成代謝途徑(圖3)。在苯丙酸生物合成途徑中，苯丙氨酸為底物，由苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonialyase，PAL)將氨基基團從苯丙氨酸分子中移除而形成了肉桂酸(Cinnamic acid)；然后在4-香豆酸-CoA連接酶(4-coumarate-CoA ligase，4CL)和肉桂酸-4羥化酶(Cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H/CYP73A)作用下，在肉桂酸分子中添加上一個羥基基團而形成對-香豆酸(p-Coumarate)；其側鏈結合輔酶A分子(CoA)，從而轉變?yōu)閷?香豆酸輔酶A分子(p-Coumarate-CoA)，作為黃酮類化合物合成的起始底物。對-香豆酰輔酶A在查爾酮合酶(Chalcone synthase，CHS)的催化下產(chǎn)生柚皮素查爾酮或異甘草素，經(jīng)查爾酮異構酶(Chalcone isomerase，CHI)作用，分別形成柚皮素或甘草素；之后，柚皮素作為中間產(chǎn)物進入代謝途徑，甘草素作為底物進入異黃酮生物合成途徑。除此之外，對-香豆酰輔酶A在莽草酸O-羥基肉桂酰基轉移酶(Shikimic acid O-hydroxy cinnamoyltransferas，HCT)、5-O-(4-香豆蔻?；?-D-奎寧酸3′-單加氧酶(5-O-(4-coumaroyl)-D-quinate 3′-monooxygenase，C3′H)作用下形成咖啡酰-CoA，經(jīng)查爾酮合酶催化形成2′，3，4，4′，6′五羥基查爾酮(2′，3，4，4′，6′Pentahydroxy chalcome)；或經(jīng)咖啡酰輔酶A O-甲基轉移酶 (Caffeoyl-CoA O-methyltransferase，CCoAOMT)催化形成阿魏酰輔酶A，再由查爾酮合酶催化形成4，2′，4′，6′，四羥基-3-甲氧基查爾酮(4，2′，4′，6′，-Tetrahydroxy-3-methoxy chalcome)。甘葛藤黃酮類的合成在不同酶的催化下參與復雜的代謝過程，產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物較多。在甘葛藤轉錄組數(shù)據(jù)中，與黃酮類合成相關的基因110個，其中，26個編碼HCT，3個編碼CHS，7個編碼CHI(表3)。

2.2.5 轉錄組中TFs和R基因分析 TFs在生物過程的基因表達模式主要起調(diào)節(jié)作用，如黃酮類化合物的生物合成途徑[16]。根據(jù)比對結果，3 507個基因被劃分到55個不同的轉錄因子家族(圖4)。其中Basic/Helix-Loop-Helix(bHLH)轉錄因子類的基因最多(290個)，其次是C2H2(249個)、TALE(225個)、C3H(221個)、WRKY(179個)、bZIP(173個)等，最少的是GRF(1)和NZZ/SPL(1)，這些轉錄因子信息為甘葛藤次生代謝產(chǎn)物的生物合成和抗逆性研究提供了依據(jù)。

植物R基因在識別病原菌的特異無毒性(Avr)基因和刺激誘導抗病的信號轉導級聯(lián)中起著關鍵作用[17]。14 127個基因被分為17個不同的R基因類別。受體樣蛋白(RLP)的種類最多(3 633個)，其次是TNL(2 729個)、N(2 239個)、NL(1 621個)、CNL(1 203個)等(圖5)；分配到PTO(1個)的基因最少，其次是RLP-Malectin(9個)和RLK-Malectin(2個)。

2.2.6 轉錄組中SSRs標記位點的分布 SSR標記被認為是基于DNA多態(tài)性的一種標記技術，是進行遺傳多樣性檢測和遺傳圖譜構建的有效工具之一[18]。從90 856個基因中篩選出了33 660個SSR，其中含有一個以上SSR的序列有6 628個，SSR以復合形式存在的序列有3 580個；在檢測到的核苷酸基序重復序列中，二核苷酸(14 778個，43.93%)和三核苷酸(12 927，38.41%)占比較多，其次為四核苷酸(2 791，8.29%)、五核苷酸(1 550，4.60%)、六核苷酸(1 614，4.80%)。類型最豐富的是AG/CT(8 863，26.33%)，其次為AT/AT(3 479，10.34%)、AC/GT(2 433，7.23%)和AAG/CTT(2 784，8.27%)(圖6)。在此基礎上，利用Primer Premier設計引物，為甘葛藤遺傳多樣性研究和遺傳圖譜構建提供了數(shù)據(jù)基礎。

3 討論

本草基因組學近幾年的發(fā)展加快了藥用植物基因資源的保護和利用。轉錄組分析是鑒定植物轉錄調(diào)控最為有效、準確和低成本的工具之一，也是本草基因組學研究的重要手段之一。在非模式植物的功能基因組學研究中，全長轉錄本提供的信息豐富，獲得能夠有力地推進相應基礎研究水平，第三代測序技術為此提供了較好的解決方案。有助于揭示其生長發(fā)育、逆境應答機制和次生代謝產(chǎn)物的富集調(diào)控機制。目前，全長轉錄組測序已經(jīng)廣泛應用于動植物和微生物測序研究中，尤其是對于沒有完成基因組序列測序的大多數(shù)藥用植物，將三代高通量測序用于植物全長轉錄組研究，對具有生物活性次級代謝物的調(diào)控基因的探索和分子標記的開發(fā)具有重要意義[10]。如在藥用模式植物丹參的研究中，基于二代測序獲得的大部分序列不具有全長cDNA特性，而利用RNA-seq、Iso-SeqNGS和SMRT技術對丹參周皮、韌皮部、木質(zhì)部進行轉錄本測序，獲得了高質(zhì)量的全長轉錄本，為丹參研究提供了完整的轉錄信息[8，19]。植物和傳統(tǒng)藥用植物中廣泛存在著植物天然化合物，天然產(chǎn)物一直以來都是研究的熱點。甘葛藤作為“藥食同源”植物，黃酮類化合物是甘葛藤的主要活性物質(zhì)之一，具有抗炎、抗氧化、保護心臟、降血糖等功效[20]，越來越受到人們的青睞。但相對于其他農(nóng)作物而言，甘葛藤的仍采用傳統(tǒng)育種手段、比較落后，且育種周期較長、選育的品種藥效難以保證。而且隨著甘葛藤化學成分及藥理作用研究的不斷深入，其轉錄組學和基因組學的研究報道甚少，這不利于甘葛藤次生代謝產(chǎn)物合成途徑的解析。本研究利用三代高通量測序平臺對甘葛藤的3個不同組織進行混合測序，組裝出90 856個單基因，有85 239個得到注釋，獲得完整的參考轉錄組。目前還缺乏甘葛藤的參考基因組，但是基于轉錄開發(fā)的SSR有助于改善甘葛藤的分子標記。同時，這些單基因序列和注釋將有助于甘葛藤中新基因的發(fā)現(xiàn)和功能基因組分析。豆科有650個屬，18 000種植物，葛屬植物有20多種，本研究可為豆科植物的分子生物學研究提供參考。此外，葛根資源的系統(tǒng)收集和評價，以及新品種的培育是今后研究的重點，可為葛產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展提供保障。