陳麗葉，常希光，馮曉光，楊肖飛，劉慧君，范俊峰，陳湘寧,

（1.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；2.北京裕農(nóng)優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品種植有限公司，北京 101400；3.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病的主要成因，在老年人中發(fā)生的概率很大[1]。在早期階段，天然低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）在動(dòng)脈內(nèi)皮內(nèi)膜積聚并氧化，形成斑塊[2-3]。因此，LDL是動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。此外，LDL糖化會(huì)形成糖化終產(chǎn)物，在人體內(nèi)積累到一定程度時(shí)，會(huì)引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化[4-5]。LDL的氧化和糖化是相互依賴的，故可以通過(guò)抑制LDL氧化和糖化過(guò)程來(lái)預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化[6]。目前，臨床上治療動(dòng)脈粥樣硬化主要是通過(guò)降低血清LDL的水平。Allen等[7]研究發(fā)現(xiàn)，煙酸也是治療動(dòng)脈粥樣硬化的廣譜脂質(zhì)調(diào)節(jié)藥物。Su Gang等[8]研究證實(shí)煙酸可能會(huì)成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)，主要是通過(guò)實(shí)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路下調(diào)來(lái)改善動(dòng)脈粥樣硬化[9]。臨床上廣泛使用的抗氧化劑和二甲雙胍有很多副作用。因此，需要更多的研究來(lái)發(fā)現(xiàn)天然的LDL氧化和糖化抑制劑，一些天然的化合物，如膽固酮、肌醇和乙基半胱氨酸，已經(jīng)被報(bào)道有明顯的抑制LDL的氧化或糖化的作用[10]。大量研究證明，從植物中提取的多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用、降血糖、降血脂、抗疲勞、抗衰老等多種功效[11-12]。劉貝女等[13]從懸鉤子木中提取了活性物質(zhì)多糖并進(jìn)行了柱色譜純化，研究發(fā)現(xiàn)3 種不同成分的多糖均可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增值和分泌白細(xì)胞介素（interleukin，IL）、γ-干擾素和腫瘤壞死因子-α。Kostalova等[14]研究發(fā)現(xiàn)南瓜果實(shí)中提取的水溶性多糖具有抗氧化性。山藥因其風(fēng)味獨(dú)特且富含多糖等多種生物活性而備受消費(fèi)者青睞。山藥多糖是山藥的主要活性成分之一，廣泛應(yīng)用于藥品、食品以及保健品中[15]。山藥粗多糖可增強(qiáng)果蠅飛翔能力，其濃度與果蠅飛翔率呈正相關(guān)。較低質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.1%、0.5%）的山藥粗多糖可縮短果蠅潛伏期時(shí)間；較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1.0%、1.5%）的山藥粗多糖可延長(zhǎng)交配時(shí)間，而且隨著山藥粗多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，果蠅子代數(shù)增加，認(rèn)為適量的山藥粗多糖能使果蠅受精卵生存力提高，使更多的受精卵發(fā)育為成蟲(chóng)[16]。山藥多糖可降低白脂肪組織中IL-1β、IL-10、瘦素水平，降低基質(zhì)金屬蛋白酶-3（matrix metalloproteinase-3，MMP-3）、NF-κB（P65）的表達(dá)，提示山藥多糖可提高胰島素敏感性，對(duì)高脂血癥有保護(hù)作用[17]。Xue Yueheng等[18]采用超濾技術(shù)分離得到的山藥多糖均具有清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基、羥自由基以及超氧陰離子自由基活性，從而發(fā)揮其抗氧化作用。Peng Cheng等[19]也探討了山藥多糖對(duì)前列腺癌細(xì)胞株和荷瘤小鼠增殖的影響及其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其通過(guò)誘導(dǎo)Caspase-3的過(guò)度表達(dá)而強(qiáng)烈抑制前列腺癌的生長(zhǎng)，可能是一種有效的抗癌策略。在糖尿病小鼠的飲食中添加粗山藥多糖被證明具有顯著的降血糖作用，且主要通過(guò)增加胰島素分泌來(lái)介導(dǎo)，從而修復(fù)受損的β細(xì)胞，消除過(guò)量的自由基[12]。然而，關(guān)于多糖能否抑制LDL的氧化和糖化進(jìn)程的報(bào)道較少。

本研究采用超聲波輔助法提取山藥多糖并除雜，對(duì)山藥多糖體外清除自由基能力和抑制LDL氧化的作用進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵棍山藥（Dioscorea opposita）購(gòu)于北京農(nóng)學(xué)院便民超市。該研究得到北京農(nóng)學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，新鮮豬血取自河北靈熙食品有限公司，并參照文獻(xiàn)[20]的方法分離血漿。

無(wú)水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、濃H2SO4（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品、間羥基聯(lián)苯、葡萄糖（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH（分析純） 美國(guó)Sigma公司；50 mmol/L Tris-HCl溶液、水楊酸、FeSO4、H2O2、肝素鈉、CuSO4、乙二胺四乙酸二鈉、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、氨基胍（aminoguanidine，AG）、TAE緩沖液、瓊脂糖（分析純） 北京化工廠；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

10F-2A型數(shù)顯電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-500DE型超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；5417R型離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；RE52-98型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；HH-S型水浴鍋 常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠；TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；XS-06A型真空冷凍干燥機(jī) 杭州翔盛氣體設(shè)備有限公司；DYY-III 2型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、DYYIII 3IA/31B型電泳槽 北京六一儀器廠；SX-300型凝膠成像系統(tǒng) 上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；LC-10A高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

新鮮鐵棍山藥洗凈，去皮，切片（1～2 cm厚），60 ℃烘干，粉碎，過(guò)60 目篩，制粉備用。

1.3.2 多糖的提取

參照文獻(xiàn)[21]并稍作修改。山藥粉20 g，按山藥粉與蒸餾水質(zhì)量比為1∶30，超聲功率600 W，提取時(shí)間60 min，提取溫度70 ℃，提取2 次，合并提取液，冷卻，在10 000 r/min下離心10 min，收集上清液，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（60 ℃）濃縮至原體積的1/5。

1.3.3 多糖的除雜

在濃縮液中加4 倍體積的無(wú)水乙醇沉淀，并于4 ℃下靜置24 h，在10 000 r/min下離心15 min。按照Sevag法除蛋白3 次[22]、活性炭脫色、透析（可截留分子質(zhì)量為8 000 Da的透析袋），最后置于－80 ℃冰箱中，待完全凍結(jié)后，在抽真空下低溫冷凍干燥至質(zhì)量不變，取出，放于4 ℃冰箱中備用。

1.3.4 多糖的組分測(cè)定

1.3.4.1 總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[23]。用250 mg葡萄糖配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液。取0.1～0.5 mL的母液定容至10 mL制成不同質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。將多糖溶液2 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%苯酚1 mL、濃H2SO45 mL充分混勻，室溫靜置10 min，沸水浴15 min，用H2O作空白對(duì)照。在490 nm處測(cè)定上述溶液吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程。樣品的測(cè)定方法同上，重復(fù)3 次，根據(jù)回歸方程求得總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.4.2 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定多糖的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.4.3 灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定參照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》測(cè)定多糖中的灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.4.4 糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[24]測(cè)定糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。從1 mg/mL的半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別移取0～0.6 mL溶液到10 mL容量瓶中并用蒸餾水定容，再分別取上述溶液1 mL與4.78 g/L的四硼酸鈉/硫酸溶液5 mL充分混勻，沸水浴5 min，冷卻，加1.5 mg/mL的間羥基聯(lián)苯溶液100 μL。用H2O做空白，在波長(zhǎng)524 nm處測(cè)吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)糖醛酸質(zhì)量濃度ρ/（mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。樣品中糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定同前所述。

1.3.5 多糖分子質(zhì)量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[25]，采用HPGPC技術(shù)，通過(guò)KS805-804-802色譜柱（7.8 mm×300 mm，8 μm）對(duì)多糖的分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。5 mg/mL多糖樣品溶液12 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后將樣品轉(zhuǎn)移至1.8 mL進(jìn)樣瓶中備用。進(jìn)樣量：20 μL；用40 ℃雙蒸餾水以0.8 mL/min的速度洗脫。以不同相對(duì)分子質(zhì)量的葡聚糖（1 152、5 220、11 600、23 800、48 600、80 900、148 000、273 000、409 800、667 800 Da）為標(biāo)準(zhǔn)品，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的分子質(zhì)量。

1.3.6 多糖的抗氧化活性測(cè)定

1.3.6.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[26]的方法并稍作修改。在試管中加入0.1 mL不同質(zhì)量濃度（0、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL和2.0 mg/mL）的多糖樣品溶液及3.9 mL DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L），37 ℃避光培養(yǎng)30 min，以H2O做空白組，VC為陽(yáng)性對(duì)照組，測(cè)定517 nm波長(zhǎng)處的吸光度。按式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A0表示空白組吸光度；A1表示樣品組的吸光度；A2表示樣品對(duì)照組的吸光度（乙醇代替反應(yīng)液）。

1.3.6.2 超氧化物自由基清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[26]的方法并稍作修改。配制不同質(zhì)量濃度（0、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL和2.0 mg/mL）的多糖樣品溶液，取0.5 mL多糖樣品溶液，加入3 倍體積50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液，30 ℃下孵育20 min。冷卻至室溫，加1.5 mL 7 mmol/L鄰苯三酚溶液。3 min后，加0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)37.5%的HCl溶液終止反應(yīng)，以VC為陽(yáng)性對(duì)照。測(cè)定320 nm波長(zhǎng)處的吸光度，按式（2）計(jì)算超氧化物自由基清除率。

式中：A0為對(duì)照組的吸光度（蒸餾水代替樣品）；A1表示樣品組的吸光度。

1.3.6.3 羥自由基清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[21]的方法并稍作修改。配制不同質(zhì)量濃度（0、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL和2.0 mg/mL）的多糖樣品溶液。在試管中分別加入1.0 mL FeSO4溶液（9 mmol/L）、樣品溶液和H2O2（9 mmol/L），室溫放10 min，最后加1.0 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，充分搖勻，37 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，在6 000 r/min下離心10 min，測(cè)定上清液在510 nm波長(zhǎng)處的吸光度，按式（3）計(jì)算羥自由基清除率。

式中：AX為樣品組吸光度；AX0為樣品對(duì)照組的吸光度（H2O代替水楊酸）；A0則表示空白對(duì)照組的吸光度（H2O代替樣品）。

1.3.7 LDL的提取及純化

參照文獻(xiàn)[20]并稍作修改。在豬血血漿中加入10 倍體積沉淀液（64 mmol/L檸檬酸鈉溶液，用5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH 5.04，肝素鈉濃度為50 000 U/L），混勻后37 ℃水浴15 min。10 000 r/min離心15 min，向沉淀中加入5 倍洗滌劑（64 mmol/L檸檬酸鈉溶液，用5 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH 5.11），10 000 r/min下離心25 min離心即得LDL沉淀。用20 倍體積的0.01 mol/L pH 8.2磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）完全溶解后4 ℃透析（可截留分子質(zhì)量為10 000 Da的透析袋）24 h。根據(jù)文獻(xiàn)[27]的方法測(cè)定LDL中的蛋白質(zhì)量濃度，并將質(zhì)量濃度調(diào)整到400 mg/L后冷凍保藏于－20 ℃冰箱中備用（貯存時(shí)間少于2 周）。

1.3.8 LDL純度鑒定

參考文獻(xiàn)[28]，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)LDL的純度進(jìn)行鑒定，0.5 mL豬血血漿（用去離子水稀釋3 倍）和0.5 mL 400 mg/L LDL中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%溴酚藍(lán)甘油染色液0.5 mL混勻，離心（4 ℃、10 000 r/min，15 min）后取上清液進(jìn)行上樣，加樣量為20 μL。電極液為pH 8.4的巴比妥酸緩沖液，電壓120 V，電泳時(shí)間50 min。用G-250染色1 h，甲醇-冰乙酸脫色，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.3.9 多糖對(duì)LDL氧化的影響

1.3.9.1 多糖對(duì)共軛二烯形成的延緩作用的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[6]并稍作修改來(lái)測(cè)定多糖對(duì)共軛二烯（conjugated dienes，CD）產(chǎn)生的延緩作用。將LDL樣品（蛋白質(zhì)量濃度為400 μg/L）在含PBS（10 mmol/L，pH 7.4）和多糖（0.2、0.4、0.6、0.8 μg/mL和1.0 μg/mL）的培養(yǎng)基中37 ℃孵育5 min，然后加入CuSO4（終濃度10 μmol/L）進(jìn)行氧化。測(cè)定時(shí)，不同時(shí)間點(diǎn)取出來(lái)自培養(yǎng)基反應(yīng)的等分試樣用于評(píng)估CD的形成，間隔40 min（0～240 min）測(cè)定234 nm波長(zhǎng)處的吸光度。CuSO4組（即促氧對(duì)照組）中的多糖樣品以等體積的甲醇代替；空白組以等體積的甲醇代替多糖樣品，以等體積的去離子水代替CuSO4溶液。

1.3.9.2 硫代巴比妥酸反應(yīng)物水平的測(cè)定

脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物通過(guò)測(cè)定硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）的水平進(jìn)行評(píng)估，具體方法參照文獻(xiàn)[6]并稍加修改。組別設(shè)置為：多糖樣品組：LDL（蛋白質(zhì)量濃度400 μg/L）含有PBS（10 μmol/L，pH 7.4）＋不同質(zhì)量濃度多糖（0.2～1.0 μg/mL）＋CuSO4（最終濃度10 μmol/L）；CuSO4組：樣品被去離子水代替；空白組：用等體積去離子水代替CuSO4和樣品。

將上述反應(yīng)體系在37 ℃下培養(yǎng)2 h。向1 mL混合物中添加50 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%乙二胺四乙酸二鈉、2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%三氯乙酸和2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.76% 2-硫代巴比妥酸進(jìn)行TBARS的顯色反應(yīng)。沸水浴35 min后冷卻，并在532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。TBARS水平按公式（4）計(jì)算。

式中：A1是CuSO4組或多糖樣品組的吸光度；A0是空白對(duì)照組的吸光度。

1.3.10 多糖對(duì)LDL糖化的影響

1.3.10.1 LDL糖化形成糖化終產(chǎn)物參照文獻(xiàn)[6]的方法稍作修改，建立LDL糖化孵育體系。組別設(shè)置如下：空白組：PBS（10 mmol/L，pH 7.4）＋LDL（蛋白質(zhì)量濃度1.4 mg/mL）；糖化模型組：PBS（10 mmol/L，pH 7.4）＋LDL（蛋白質(zhì)量濃度1.4 mg/mL）＋葡萄糖（500 mmol/L）；陽(yáng)性對(duì)照組：PBS（10 mmol/L，pH 7.4）＋AG（10 mmol/L）＋LDL（蛋白質(zhì)量濃度1.4 mg/ mL）＋葡萄糖（500 mmol/L）；多糖樣品組：PBS（10 mmol/L，pH 7.4）＋多糖溶液（質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL）＋LDL（蛋白質(zhì)量濃度1.4 mg/mL）＋葡萄糖（500 mmol/L）。各組樣品在37 ℃下培養(yǎng)48 h，并于10 mmol/L PBS（pH 7.4）中4 ℃透析。

1.3.10.2 瓊脂糖凝膠電泳

參照文獻(xiàn)[23]的方法并稍作修改，在TAE緩沖液中進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組別與1.3.10.1節(jié)相同，具體操作方法和實(shí)驗(yàn)條件同1.3.8節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有結(jié)果均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，通過(guò)鄧肯多重比較進(jìn)行事后檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥多糖的組分分析

由表1可知，山藥多糖中的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（65.79±1.03）%，說(shuō)明提取的多糖較純。蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（5.89±0.43）%，于海芬[29]研究結(jié)果表明，用Sevag法脫蛋白8 次后，多糖的脫蛋白率為55.77%，表明多糖中的蛋白質(zhì)不是特別容易被完全去除，而且可能與多糖發(fā)生共價(jià)反應(yīng)。灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（5.51±0.14）%，說(shuō)明山藥多糖中含有礦物質(zhì)。糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)（10.81±1.14）%。

表1 山藥多糖的化學(xué)組成Table1 Chemical composition of Chinese yam polysaccharides

2.2 山藥多糖的分子質(zhì)量

如圖1A所示，HPGPC洗脫出的峰主要集中在40～45 min之間。以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1B，根據(jù)lgmw-tR（mw表示分子質(zhì)量/Da；tR表示保留時(shí)間/min）校正曲線方程y＝－0.200 2x＋12.75，R2＝0.994 8計(jì)算可得出多糖的分子質(zhì)量。多糖主要由4 個(gè)多糖組分組成，分別為933 742 Da（tR＝33.865 min）、148 878 Da（tR＝37.848 min）、39 233 Da（tR＝40.741 min）、17 318 Da（tR＝42.515 min）。這一結(jié)果與Yang Weifang等[30]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，其用熱水浸提法得到粗多糖，對(duì)得到的粗多糖進(jìn)行Sevag法脫蛋白，然后采用Sephadex G-100柱色譜法進(jìn)一步純化得到純多糖，HPGPC分析結(jié)果顯示只有一個(gè)單峰，對(duì)應(yīng)的分子質(zhì)量為16 619 Da。分析造成結(jié)果不同的原因可能是提取多糖的條件和除雜方法不同。

圖1 山藥多糖的HPGPC洗脫曲線（A）和分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）Fig. 1 High performance gel permeation chromatography elution curve of polysaccharides from Chinese yam (A) and standard curve for molecular mass estimation (B)

2.3 山藥多糖的抗氧化性

2.3.1 山藥多糖的DPPH自由基清除率

由圖2可知，陽(yáng)性對(duì)照VC具有很強(qiáng)的抗氧化性，其DPPH自由基清除率在質(zhì)量濃度為0～0.4 mg/mL時(shí)快速增加，0.4～0.8 mg/mL時(shí)增加緩慢，之后趨于平穩(wěn)。山藥多糖的DPPH自由基清除率和質(zhì)量濃度呈線性依賴關(guān)系，且相同質(zhì)量濃度下，山藥多糖的DPPH自由基清除率顯著低于VC（P＜0.05）。經(jīng)計(jì)算得山藥多糖的半抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為1.06 mg/mL，當(dāng)質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，山藥多糖的DPPH自由基清除率可達(dá)（79.0±0.2）%。

圖2 不同質(zhì)量濃度下山藥多糖的DPPH自由基清除率Fig. 2 DPPH radical scavenging capacity of Chinese yam polysaccharides at different concentrations

2.3.2 山藥多糖的超氧化物自由基清除率

山藥多糖對(duì)超氧化物自由基的清除能力如圖3所示，VC對(duì)超氧化物自由基活性的抑制趨勢(shì)與DPPH自由基相近，山藥多糖在質(zhì)量濃度0～1.2 mg/mL范圍內(nèi)增加時(shí)，其超氧化物自由基清除率明顯增加，在1.2～2.0 mg/mL范圍內(nèi)增加時(shí)增加緩慢。山藥多糖對(duì)超氧化物自由基的IC50為1.06 mg/mL，這與Yang Weifang等[30]的研究結(jié)果相似，其對(duì)山藥多糖進(jìn)行純化后得當(dāng)山藥多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧化物自由基的清除率為43%。當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，山藥多糖對(duì)超氧化物自由基的清除率可達(dá)（76.0±2.8）%。

圖3 不同質(zhì)量濃度下山藥多糖的超氧化物自由基清除率Fig. 3 Superoxide radical scavenging capacity of Chinese yam polysaccharides at different concentrations

2.3.3 山藥多糖的羥自由基清除率

圖4反映了不同質(zhì)量濃度山藥多糖對(duì)羥自由基的清除率，山藥多糖對(duì)羥自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度（0～2.0 mg/mL）的增加而增加，表現(xiàn)出良好的質(zhì)量濃度依賴關(guān)系。山藥多糖對(duì)羥自由基的IC50為0.98 mg/mL。當(dāng)山藥多糖質(zhì)量濃度達(dá)2.0 mg/mL時(shí)，其羥自由基清除率為（65.0±0.4）%。

圖4 不同質(zhì)量濃度下山藥多糖的羥自由基清除率Fig. 4 Hydroxyl radical scavenging capacity of Chinese yam polysaccharides at different concentrations

2.4 LDL純度鑒定結(jié)果

如圖5所示，與血漿（泳道1）相比，純化后的LDL顯示出單一的條帶，且顏色較淺（泳道2），說(shuō)明所制備的LDL純度較高，這與王麗麗等[28]的研究結(jié)果一致。

圖5 LDL瓊脂糖凝膠電泳Fig. 5 Agarose gel electrophoresis of purified LDL

2.5 山藥多糖對(duì)LDL氧化的影響

2.5.1 山藥多糖對(duì)共軛二烯形成的延緩作用

CD的形成是LDL氧化在延遲、增殖和早期降解階段動(dòng)態(tài)變化的重要指標(biāo)?；谏鲜鼋Y(jié)果，進(jìn)一步研究了山藥多糖對(duì)LDL氧化的抑制作用。吸收度變化越小，表明抑制LDL氧化的作用越強(qiáng)。由圖6可知，空白組和多糖組的吸光度變化均低于CuSO4組，表明多糖能有效延緩CuSO4誘導(dǎo)LDL氧化過(guò)程中CD的形成。反應(yīng)40 min時(shí)，空白組、CuSO4組、多糖組（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL）的吸光度分別變化0.016、0.105、0.054、0.048、0.043、0.039、0.036。120 min后，多糖組的組間吸光度差異顯著（P＜0.05），當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到240 min時(shí)，空白組、CuSO4組、多糖組（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL）的吸光度分別變化0.167、0.725、0.485、0.480、0.460、0.450、0.436。這些結(jié)果表明，山藥多糖可通過(guò)延緩CD的形成時(shí)間來(lái)降低LDL氧化速率，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

圖6 不同質(zhì)量濃度山藥多糖對(duì)CD形成的延緩作用Fig. 6 Inhibitory effect of different concentrations of Chinese yam polysaccharides on conjugated dienes formation

2.5.2 山藥多糖對(duì)硫代巴比妥酸反應(yīng)物形成的影響

隨著LDL脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的進(jìn)形，LDL氧化修飾進(jìn)入降解階段，導(dǎo)致在增殖期產(chǎn)生的LOOH發(fā)生降解，形成大量的有毒醛，與硫代巴比妥酸反應(yīng)生成在532 nm波長(zhǎng)處有特征吸收峰的粉紅色物質(zhì)。通過(guò)測(cè)定TBARS水平，可進(jìn)一步確定山藥多糖對(duì)降解階段LDL氧化的延遲作用。如圖7所示，山藥多糖在1.0 μg/mL時(shí)對(duì)LDL氧化的抑制效果最好，對(duì)TBARS產(chǎn)生的抑制率為促氧對(duì)照組的16.28%，但是質(zhì)量濃度在0.4～0.8 μg/mL時(shí)對(duì)LDL氧化抑制效果差異不顯著（P＞0.05）。總的來(lái)說(shuō)，山藥多糖可以抑制TBARS的產(chǎn)生，并且呈現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴關(guān)系。

圖7 山藥多糖對(duì)CuSO4誘導(dǎo)LDL氧化時(shí)TBARS產(chǎn)生的影響Fig. 7 Inhibitory effect of Chinese yam polysaccharides on TBARS production during LDL oxidation induced by CuSO4

2.6 山藥多糖對(duì)LDL糖化的影響

人體內(nèi)糖化終產(chǎn)物含量過(guò)高會(huì)引發(fā)高血糖等疾病。因此，進(jìn)一步研究山藥多糖對(duì)LDL糖化的影響，以探討山藥多糖是否可以通過(guò)多途徑抑制LDL的氧化。如圖8所示，糖化模型組電泳遷移距離最長(zhǎng)（5.2 cm），陽(yáng)性對(duì)照組電泳遷移距離最短。多糖樣品組的遷移距離為4.7 cm，明顯短于糖化模型組的遷移距離，略短于空白組，但是比陽(yáng)性對(duì)照組的遷移距離長(zhǎng)，說(shuō)明山藥多糖對(duì)LDL糖化有抑制作用，但是效果不明顯。

圖8 山藥多糖對(duì)瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定LDL糖化的影響Fig. 8 Effect of Chinese yam polysaccharides on LDL glycation evaluated by agarose gel electrophoresis

3 結(jié) 論

本研究以山藥為試材，對(duì)山藥多糖進(jìn)行提取除雜。對(duì)純山藥多糖的化學(xué)組成和體外清除自由基的能力進(jìn)行了分析，對(duì)山藥多糖能否抑制LDL的氧化進(jìn)程進(jìn)行了探討。結(jié)果表明，山藥多糖的化學(xué)組成為：總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（65.79±1.03）%、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5.89±0.43）%、灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5.51±0.14）%、糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（10.81±1.14）%。與VC相比，在相同質(zhì)量濃度條件下，山藥多糖的自由基清除率顯著低于VC，對(duì)DPPH自由基、超氧化物自由基和羥自由基的清除能力的IC50分別為1.06、1.06 mg/mL和0.98 mg/mL。山藥多糖不僅可以有效延緩LDL氧化過(guò)程中CD的形成和TBARS的產(chǎn)生，還對(duì)LDL糖化有抑制作用。值得注意的是，在山藥多糖提取物中可能存在糖蛋白，該物質(zhì)也可參與到抑制LDL的氧化進(jìn)程中來(lái)。因此，未來(lái)山藥山藥多糖的研究重點(diǎn)可以從糖蛋白的角度出發(fā)進(jìn)一步研究山藥多糖抑制LDL氧化進(jìn)程的機(jī)制。