范春暉，高宗曄，姚善涇，林東強

（浙江大學化學工程與生物工程學院，生物質(zhì)化工教育部重點實驗室，浙江杭州310027）

引 言

單克隆抗體（單抗）是最重要的生物技術(shù)藥物[1-2]。蛋白A親和層析常用于細胞培養(yǎng)液中直接捕獲抗體，選擇性高，分離效果好[3-4]。不過，蛋白A親和介質(zhì)價格昂貴，導(dǎo)致成本較高[5]。研發(fā)新型蛋白A親和介質(zhì)，提高載量、吸附選擇性和使用壽命等，是降低單抗生產(chǎn)成本的關(guān)鍵途徑[6-7]。

實際應(yīng)用中，蛋白A親和介質(zhì)對抗體表現(xiàn)出高選擇性[8]，但也有研究發(fā)現(xiàn)其對雜質(zhì)仍有一定量的非特異性吸附[9-11]。隨著細胞表達水平提升，培養(yǎng)液組分越加復(fù)雜，非特異性吸附成為影響介質(zhì)壽命的重要因素[12-13]。研究表明，非特異性吸附不僅會降低蛋白A親和介質(zhì)的抗體結(jié)合載量[14-16]，也會影響后續(xù)的精制純化[17]。NaOH溶液可以有效清除介質(zhì)吸附的雜質(zhì)，但是蛋白A配基對堿敏感，反復(fù)暴露于堿環(huán)境會影響抗體載量和介質(zhì)使用壽命[18-20]。多年來，不同公司推出了多種商業(yè)化的蛋白A親和介質(zhì)，配基來源、偶聯(lián)方法和配基密度以及基質(zhì)結(jié)構(gòu)和材料等各不相同，介質(zhì)性能也有較大差異，如動態(tài)載量、洗脫收率、耐堿性和使用壽命等[21-25]。絕大多數(shù)研究集中于載量提升和耐堿性，對于介質(zhì)非特異性吸附，特別是非特異性吸附的量化表征，缺乏有效的分析手段。Shukla等[10]采用ELISA方法考察了洗脫液中宿主細胞蛋白的含量，以表征介質(zhì)的非特異性吸附，不過有些與介質(zhì)結(jié)合作用較強的雜質(zhì)未能進入洗脫液，導(dǎo)致該方法并不能準確反映介質(zhì)的非特異性吸附。

在擴張床吸附研究中，為了考察細胞和細胞碎片等生物質(zhì)對床層穩(wěn)定性的影響，提出了一種量化表征方法，稱為生物質(zhì)脈沖響應(yīng)法[26-27]。通過檢測生物質(zhì)脈沖進入和離開擴張床的量，二者的比值定義為生物質(zhì)穿透指數(shù)（BTI），來衡量介質(zhì)對生物質(zhì)的吸附程度，BTI越小則說明生物質(zhì)在擴張床中的吸附越嚴重[28-30]。

借鑒擴張床吸附研究中的生物質(zhì)脈沖響應(yīng)法，本文針對蛋白A親和介質(zhì)的非特異性吸附，建立量化表征方法，并以牛血清白蛋白（BSA）、畢赤酵母細胞培養(yǎng)液和CHO細胞培養(yǎng)液中雜蛋白作為典型雜質(zhì)，考察不同類型的蛋白A親和介質(zhì)和兩種基質(zhì)微球的非特異性吸附，探討介質(zhì)非特異性吸附的相關(guān)機制，為新型蛋白A親和層析介質(zhì)的研發(fā)提供分析新方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

主要試劑：BSA（等電點4.7，分子量66.7×103），生工生物工程（上海）股份有限公司；CHO細胞培養(yǎng)液，某生物技術(shù)公司。蛋白A親和層析介質(zhì)與基質(zhì)的相關(guān)信息匯總見表1，其中4FF和HW-65F分別為rProA介質(zhì)和HC-650F介質(zhì)所對應(yīng)基質(zhì)微球。

表1 本文表征的Protein A親和層析介質(zhì)與基質(zhì)Table 1 Protein A affinity chromatography resins and matrices

儀器：?KTAprime plus層析系統(tǒng)和Tricorn 5/200層析柱（5 mm×200 mm），GE Healthcare Life Sciences公司；電子切換閥（六通閥），KNAUER公司；One Drop OD-1000+分光光度計，南京五義科技有限公司；超濾離心管（10 kD），Merck公司。

1.2 細胞培養(yǎng)液處理

取畢赤酵母（Pichia pastorisGS115）或CHO細胞培養(yǎng)液在10000 r/min條件下離心15 min，得到上清液；0.22μm濾膜過濾，去除殘余的細胞碎片；過濾得到的培養(yǎng)液加入到10 kD超濾離心管中，在9000 r/min下離心30 min，以去除小分子物質(zhì)，得到組分主要是大分子的細胞料液，作為典型的細胞培養(yǎng)雜質(zhì)。

1.3 介質(zhì)非特異性吸附的定量表征

1.3.1 定量表征方法Tricorn 5/200層析柱裝填介質(zhì)4 ml，柱徑為5 mm，柱高約20 cm。?KTAprime plus層析系統(tǒng)（GE Healthcare公司）與電子切換閥（KNAUER公司）連接，形成脈沖響應(yīng)法檢測系統(tǒng)，具體見圖1。利用電子切換閥實現(xiàn)兩種狀態(tài)的液流轉(zhuǎn)換，從而檢測上樣脈沖在層析柱前和柱后的UV響應(yīng)。采用平衡緩沖液平衡系統(tǒng)和層析柱；上樣時，電子切換閥處于Inject狀態(tài)，上樣一定量的料液，此時UV檢測器位于層析柱之前，280 nm波長檢測上樣的蛋白量；上樣后，電子切換閥轉(zhuǎn)換至Load狀態(tài)，平衡緩沖液沖洗，此時UV檢測器處于層析柱之后，可以檢測料液經(jīng)層析柱后殘余的蛋白量。比較層析柱前后的蛋白量，可得到介質(zhì)對料液中蛋白的吸附量，定義介質(zhì)的非特異性吸附指數(shù)A為介質(zhì)吸附雜蛋白量與上樣雜蛋白量的比值，具體計算公式如下：

圖1 介質(zhì)非特異性吸附定量表征方法示意圖Fig.1 Scheme of quantitative characterization method for non-specific adsorption of resin

A值范圍為0~1，A值越大，表明介質(zhì)對雜質(zhì)的非特異性吸附作用越強。A=1，表明上樣雜質(zhì)完全被介質(zhì)吸附，非特異性吸附較嚴重；若A為0，則表明介質(zhì)對測定的雜質(zhì)基本沒有非特異性吸附。

1.3.2 介質(zhì)非特異性吸附的測定方法 配制20 mmol/L乙酸鈉緩沖液（pH 4.0和pH 5.0）、20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0）、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 9.0）和0.1 mol/L NaOH溶液。Tricorn 5/200層析柱裝填介質(zhì)4 ml，電子切換閥處于Inject狀態(tài)，緩沖液平衡系統(tǒng)和層析柱，流速0.5 ml/min，不同pH緩沖液配制的料液上樣100μl，UV檢測出現(xiàn)響應(yīng)峰；當UV280nm響應(yīng)接近于基線，電子切換閥轉(zhuǎn)換至Load狀態(tài)，用相應(yīng)緩沖液平衡沖洗，UV檢測出現(xiàn)響應(yīng)峰；直至UV280nm響應(yīng)再次接近基線，用0.1 mol/L NaOH溶液在0.3 ml/min流速下清洗再生，最后用平衡緩沖液再平衡。得到料液經(jīng)過層析柱前后的UV280nm響應(yīng)曲線面積，通過式（1）計算介質(zhì)的非特異性吸附指數(shù)A值。每個條件測試三次，取平均值。

選擇A值較高的pH緩沖液加鹽配制不同濃度的NaCl溶液（0.1、0.25、0.5、1.0 mol/L），進一步考察不同鹽濃度條件下介質(zhì)對雜質(zhì)的非特異性吸附。每個條件測試三次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 脈沖響應(yīng)法測定條件優(yōu)化

采用雜質(zhì)脈沖響應(yīng)法測定介質(zhì)的非特異性吸附，設(shè)定流速為0.5 ml/min，為保證足夠的停留時間便于后續(xù)實現(xiàn)液流轉(zhuǎn)換，選擇4 ml床層體積，柱高20 cm。實驗發(fā)現(xiàn)兩個操作因素對A值影響較大，分別為上樣蛋白濃度和上樣蛋白液量。保持上樣蛋白液量100μl（2.5%床層體積）不變，分別以不同濃度BSA溶液上樣，得到介質(zhì)非特異性吸附指數(shù)A值變化見圖2（a）。比較發(fā)現(xiàn)，較高蛋白濃度上樣時，得到A值偏??；上樣濃度過低，柱后響應(yīng)峰過小，導(dǎo)致峰面積計算相對誤差較大。綜合比較，確定0.5 mg/ml為合適的上樣蛋白濃度。保持上樣蛋白濃度為0.5 mg/ml，考察不同蛋白上樣量的影響，結(jié)果如圖2（b）所示。結(jié)果表明，較高上樣量的A值偏??；而過小的液量上樣，柱后UV響應(yīng)峰過小，相對誤差較大。綜合考慮層析柱前后UV響應(yīng)峰面積相對值和柱后響應(yīng)面積大小兩個因素，選擇2.5%床層體積（100μl）作為合適的上樣蛋白液量。

圖2 不同上樣蛋白濃度（a）和上樣蛋白液量（b）對A值測定的影響Fig.2 Effect of loading protein concentration(a)and protein solution volume(b)on the measurement of A

2.2 不同介質(zhì)非特異性吸附比較

選擇四種蛋白A親和介質(zhì)，分別是兩種以瓊脂糖微球作為基質(zhì)的rProA和PrismA介質(zhì)、以聚甲基丙烯酸酯微球為基質(zhì)的HC-650F介質(zhì)和以聚乙烯醚微球為基質(zhì)的EA介質(zhì)，在不同pH和鹽濃度下，以三種料液（BSA蛋白溶液、酵母細胞培養(yǎng)液和CHO細胞培養(yǎng)液）上樣，測定非特異性吸附指數(shù)A值，比較不同介質(zhì)對雜質(zhì)的非特異性吸附情況。

2.2.1 介質(zhì)對BSA的非特異性吸附 以BSA蛋白溶液上樣，考察了不同蛋白A親和介質(zhì)的A值，溶液pH影響見圖3（a）。結(jié)果表明，四種介質(zhì)在酸性條件下的A值均高于中性和堿性條件，說明低pH時，四種介質(zhì)與BSA之間存在較強的相互作用。在pH 6~9條件下，以交聯(lián)瓊脂糖微球作為基質(zhì)的rProA和PrismA介質(zhì)的A值比較接近，推測rProA和PrismA介質(zhì)對BSA的吸附主要依賴其瓊脂糖微球基質(zhì)。以聚甲基丙烯酸酯作為基質(zhì)材料的HC-650F介質(zhì)在不同條件下的A值均偏高，表明該介質(zhì)對BSA的非特異性吸附較強。相比其他三種介質(zhì)，以聚乙烯醚作為基質(zhì)的EA介質(zhì)的A值相對較小，表明EA介質(zhì)與BSA間的相互作用較弱，在中性或偏堿性條件下，幾乎沒有BSA結(jié)合。

圖3 不同介質(zhì)和基質(zhì)微球?qū)SA吸附A值比較Fig.3 Comparison of the A value of BSA adsorption with different resins and matrix microspheres under different conditions

在酸性條件下（pH 4或5），考察了添加鹽的影響，結(jié)果見圖3（b）。加鹽后rProA、PrismA和EA介質(zhì)的A值大幅減小，當NaCl達到0.25 mol/L后，A值基本不變，表明這三種介質(zhì)在低pH時與BSA之間可能同時存在靜電和疏水相互作用，加鹽屏蔽了部分靜電相互作用，導(dǎo)致A值有所下降。發(fā)現(xiàn)HC-650F介質(zhì)的A值幾乎不受鹽濃度影響，保持在1.0左右，表明該介質(zhì)可能主要通過疏水相互作用結(jié)合BSA。

2.2.2 介質(zhì)對酵母細胞培養(yǎng)液中雜質(zhì)的非特異性吸附 以酵母細胞培養(yǎng)液上樣，四種介質(zhì)在不同條件下的A值見圖4。與BSA類似，四種介質(zhì)在酸性條件下的A值均高于中性或偏堿性條件，表明低pH條件促進介質(zhì)與酵母培養(yǎng)液中蛋白雜質(zhì)的結(jié)合。在pH 6~9時，以瓊脂糖微球為基質(zhì)的rProA和PrismA介質(zhì)以及聚乙烯醚為基質(zhì)的EA介質(zhì)測得的A值均小于0.1，表明這三種介質(zhì)在中性或偏堿性條件下幾乎不吸附酵母培養(yǎng)液中蛋白雜質(zhì)，可作為親和吸附抗體的理想條件。以聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的HC-650F介質(zhì)在pH 6~9時的A值在0.25以上，與酵母細胞培養(yǎng)液中雜質(zhì)相互作用較強。pH 4時，加鹽后四種介質(zhì)的A值均有不同程度的降低，但當鹽濃度高于0.25 mol/L，A值維持穩(wěn)定，表明對于酵母細胞培養(yǎng)液中的蛋白雜質(zhì)，四種介質(zhì)的吸附可能兼有靜電和疏水作用力，加鹽可在一定程度上降低介質(zhì)的非特異性吸附，但不能完全消除。

圖4 不同介質(zhì)和基質(zhì)微球?qū)湍讣毎囵B(yǎng)液吸附A值比較Fig.4 Comparison of the A value of yeast broth adsorption with different resins and matrix microspheres under different conditions

2.2.3 介質(zhì)對CHO細胞培養(yǎng)液中雜質(zhì)的非特異性吸附 以CHO細胞培養(yǎng)液上樣，不同條件下四種介質(zhì)的A值比較見圖5。與前文類似，四種介質(zhì)對雜質(zhì)均有一定吸附作用，且不同介質(zhì)存在差異。rProA介質(zhì)對CHO細胞培養(yǎng)液中雜質(zhì)的吸附作用較弱，且不受pH影響。以聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的HC-650F介質(zhì)在不同pH條件下的非特異性吸附均處于較高水平。PrismA和EA介質(zhì)在不同pH下測定的A值有較大差異，堿性條件可有效屏蔽PrismA和EA介質(zhì)與CHO細胞培養(yǎng)液中雜質(zhì)的相互作用。

pH 4時，考察了添加鹽的影響，結(jié)果見圖5（b）?？梢园l(fā)現(xiàn)，加鹽后四種介質(zhì)的A值均有不同程度的降低。高鹽濃度（1.0 mg/ml）下，以瓊脂糖微球為基質(zhì)的rProA、PrismA介質(zhì)和以聚乙烯醚微球為基質(zhì)的EA介質(zhì)對CHO培養(yǎng)液中雜質(zhì)幾乎沒有吸附，雜質(zhì)結(jié)合可能主要基于靜電相互作用。對于聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的HC-650F介質(zhì)，即使在高鹽條件下，仍有一定量的雜質(zhì)吸附，表明可能存在一定程度的疏水結(jié)合。因此，以CHO細胞培養(yǎng)液上樣時，可通過添加鹽顯著減少rProA、PrismA和EA介質(zhì)對雜質(zhì)的吸附。

圖5 不同介質(zhì)和基質(zhì)微球?qū)HO細胞培養(yǎng)液吸附A值比較Fig.5 Comparison of the A value of CHO broth adsorption with different resins and matrix microspheres under different conditions

2.2.4 比較分析 比較不同料液上樣時四種蛋白A親和介質(zhì)的A值變化情況可知，介質(zhì)對雜質(zhì)有一定吸附作用，且不同介質(zhì)存在差異，這與文獻結(jié)果相似[10,31]。此外，對于不同料液，同一介質(zhì)的非特異性吸附也有所不同。

（1）對于兩種以瓊脂糖微球作為基質(zhì)的rProA和PrismA介質(zhì)，以BSA蛋白溶液和酵母細胞培養(yǎng)液上樣時，變化情況基本一致，即酸性條件下A值較大，在pH 6~9時對雜質(zhì)的吸附作用較小。同時，加鹽可有效降低A值，但鹽濃度增加至0.5 mol/L時，A值不會進一步降低，說明這兩種介質(zhì)對BSA和酵母雜質(zhì)的吸附可能兼有靜電和疏水作用力，且主要依賴于瓊脂糖微球的吸附作用。CHO細胞培養(yǎng)液上樣時，rProA介質(zhì)與雜質(zhì)的相互作用較小，幾乎不受pH影響，加鹽可大幅降低A值；PrismA介質(zhì)對雜質(zhì)的吸附作用相對偏高，隨pH增高而減弱，高鹽條件下，介質(zhì)對雜質(zhì)幾乎沒有吸附。說明兩種介質(zhì)對CHO雜質(zhì)的吸附主要基于靜電作用，且加鹽可有效屏蔽非特異性吸附。

（2）以聚甲基丙烯酸酯微球作為基質(zhì)的HC-650F介質(zhì)，在不同條件下的A值均高于其余三種介質(zhì)，對雜質(zhì)表現(xiàn)出較強的吸附作用。以BSA蛋白溶液和酵母細胞培養(yǎng)液上樣時，酸性條件下HC-650F介質(zhì)與雜質(zhì)間的相互作用強于中性與堿性條件，然而介質(zhì)對CHO細胞培養(yǎng)液中雜質(zhì)的吸附作用幾乎不受pH影響。比較鹽濃度對A值影響可知，HC-650F介質(zhì)主要通過疏水作用吸附BSA蛋白，對酵母和CHO雜質(zhì)的吸附作用兼有靜電和疏水作用。

（3）以聚乙烯醚微球作為基質(zhì)的EA介質(zhì)，對三種料液中雜質(zhì)的吸附隨pH和鹽濃度變化趨勢與PrismA介質(zhì)相似。在中性或偏堿性條件下，EA介質(zhì)對BSA和酵母細胞培養(yǎng)液中雜質(zhì)幾乎沒有吸附，且加鹽可有效降低非特異性吸附，但鹽濃度增至0.25 mol/L時，A值不會進一步減少，說明EA介質(zhì)吸附雜質(zhì)兼有靜電和疏水作用。以CHO細胞培養(yǎng)液上樣時，介質(zhì)對雜質(zhì)的吸附作用相對較高，隨著pH升高而減小，且高鹽濃度下幾乎不吸附雜質(zhì)，說明EA介質(zhì)與CHO雜質(zhì)主要通過靜電相互作用，高鹽或堿性條件可屏蔽非特異性吸附。

2.3 介質(zhì)與基質(zhì)材料的非特異性吸附比較

為探究基質(zhì)材料的影響，分別以rProA介質(zhì)及其瓊脂糖微球基質(zhì)4FF和HC-650F介質(zhì)及其聚甲基丙烯酸酯微球基質(zhì)HW-65F為典型代表，比較三種料液的非特異性吸附情況，結(jié)果見圖3~圖5。

2.3.1 瓊脂糖4FF基質(zhì)BSA蛋白溶液和酵母細胞培養(yǎng)液上樣時，rProA介質(zhì)和4FF基質(zhì)的A值在低pH時較高，表明酸性條件下兩者的雜質(zhì)吸附作用較強。pH4或5時，兩者A值差異較大，推測低pH條件下rProA介質(zhì)的蛋白A配基與BSA和酵母料液中蛋白雜質(zhì)之間也有一定的相互作用，這與González-Valdez等[32]的研究結(jié)果相似。在中性和偏堿性條件下，兩者A值接近，說明rProA介質(zhì)對BSA和酵母料液中蛋白雜質(zhì)的非特異性吸附主要來源于其基質(zhì)4FF。對于CHO細胞培養(yǎng)液，所測pH范圍內(nèi)兩者的A值均比較相近，進一步證實該瓊脂糖基介質(zhì)的非特異性吸附主要依賴其基質(zhì)微球與雜質(zhì)間相互作用。加鹽后，介質(zhì)與基質(zhì)的A值均有不同程度的降低，表明雜蛋白結(jié)合兼有靜電和疏水作用。

2.3.2 聚甲基丙烯酸酯HW-65F基質(zhì) 以三種料液上樣，在考察的pH范圍內(nèi)，HC-650F介質(zhì)的A值顯著大于HW-65F基質(zhì)，表明HC-650F介質(zhì)對雜質(zhì)蛋白的高吸附并非主要來自聚甲基丙烯酸酯基質(zhì)材料，可能配基與雜質(zhì)間存在一定的相互作用。加鹽后，HW-65F基質(zhì)的A值相應(yīng)降低，而HC-650F介質(zhì)的A值幾乎沒有變化，推測HC-650F介質(zhì)的親和配基與BSA之間存在較強的疏水相互作用，具體原因有待進一步深入探討。

2.3.3 基質(zhì)材料的非特異性吸附比較 基質(zhì)是蛋白A親和介質(zhì)的重要組成部分，通過比較不同基質(zhì)材料的A值，有助于深入了解介質(zhì)非特異性吸附的作用機理。分析上述兩種基質(zhì)材料的結(jié)果可知：（1）對于三種料液，在中性或偏堿性條件下，兩種基質(zhì)材料的A值相近，表明兩者對雜質(zhì)的吸附作用大小接近。（2）BSA蛋白溶液和酵母細胞培養(yǎng)液上樣時，pH 4、加鹽后兩種基質(zhì)微球的A值相近，推測該條件下兩種基質(zhì)對BSA和酵母雜質(zhì)的疏水相互作用強度相似。（3）CHO細胞培養(yǎng)液上樣時，pH 4、加鹽后4FF基質(zhì)的A值大幅降低并保持在0.04左右，表明加鹽可有效屏蔽4FF基質(zhì)對CHO雜質(zhì)的吸附作用。但是，加鹽并未顯著降低HW-65F基質(zhì)的A值，說明該基質(zhì)可能通過疏水相互作用吸附CHO雜質(zhì)。

3 結(jié) 論

針對親和層析介質(zhì)非特異性吸附，建立了定量表征方法，優(yōu)化了操作條件，并以BSA、酵母發(fā)酵液和CHO細胞培養(yǎng)液作為典型蛋白雜質(zhì)，考察了四種蛋白A親和介質(zhì)和兩種基質(zhì)微球的非特異性吸附。發(fā)現(xiàn)所測介質(zhì)和基質(zhì)對雜質(zhì)均存在一定的吸附作用，且不同介質(zhì)和基質(zhì)與不同雜質(zhì)間作用機制有所不同。中性或偏堿性條件下，四種介質(zhì)對雜質(zhì)的吸附作用相對較弱，酸性條件促進雜質(zhì)吸附。pH 6~9時，rProA、PrismA和EA三種介質(zhì)對BSA和酵母雜質(zhì)幾乎不吸附，HC-650F介質(zhì)對雜質(zhì)的吸附作用強于其余三種介質(zhì)。rProA介質(zhì)吸附雜質(zhì)主要依賴其基質(zhì)微球與雜質(zhì)間相互作用，HC-650F介質(zhì)與其基質(zhì)對雜質(zhì)的吸附作用大小有較大差異，推測其蛋白A配基與雜質(zhì)間存在一定的相互作用。結(jié)果表明，本文提出的定量表征方法切實可行，可用于考察親和層析介質(zhì)的非特異性吸附，探究介質(zhì)吸附雜質(zhì)的作用機制，為新型蛋白A親和層析介質(zhì)的研發(fā)提供分析新方法。