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        親和層析介質(zhì)非特異性吸附的定量表征研究

        2021-10-31 23:37:08范春暉高宗曄姚善涇林東強
        化工學報 2021年10期

        范春暉,高宗曄,姚善涇,林東強

        (浙江大學化學工程與生物工程學院,生物質(zhì)化工教育部重點實驗室,浙江杭州310027)

        引 言

        單克隆抗體(單抗)是最重要的生物技術(shù)藥物[1-2]。蛋白A親和層析常用于細胞培養(yǎng)液中直接捕獲抗體,選擇性高,分離效果好[3-4]。不過,蛋白A親和介質(zhì)價格昂貴,導(dǎo)致成本較高[5]。研發(fā)新型蛋白A親和介質(zhì),提高載量、吸附選擇性和使用壽命等,是降低單抗生產(chǎn)成本的關(guān)鍵途徑[6-7]。

        實際應(yīng)用中,蛋白A親和介質(zhì)對抗體表現(xiàn)出高選擇性[8],但也有研究發(fā)現(xiàn)其對雜質(zhì)仍有一定量的非特異性吸附[9-11]。隨著細胞表達水平提升,培養(yǎng)液組分越加復(fù)雜,非特異性吸附成為影響介質(zhì)壽命的重要因素[12-13]。研究表明,非特異性吸附不僅會降低蛋白A親和介質(zhì)的抗體結(jié)合載量[14-16],也會影響后續(xù)的精制純化[17]。NaOH溶液可以有效清除介質(zhì)吸附的雜質(zhì),但是蛋白A配基對堿敏感,反復(fù)暴露于堿環(huán)境會影響抗體載量和介質(zhì)使用壽命[18-20]。多年來,不同公司推出了多種商業(yè)化的蛋白A親和介質(zhì),配基來源、偶聯(lián)方法和配基密度以及基質(zhì)結(jié)構(gòu)和材料等各不相同,介質(zhì)性能也有較大差異,如動態(tài)載量、洗脫收率、耐堿性和使用壽命等[21-25]。絕大多數(shù)研究集中于載量提升和耐堿性,對于介質(zhì)非特異性吸附,特別是非特異性吸附的量化表征,缺乏有效的分析手段。Shukla等[10]采用ELISA方法考察了洗脫液中宿主細胞蛋白的含量,以表征介質(zhì)的非特異性吸附,不過有些與介質(zhì)結(jié)合作用較強的雜質(zhì)未能進入洗脫液,導(dǎo)致該方法并不能準確反映介質(zhì)的非特異性吸附。

        在擴張床吸附研究中,為了考察細胞和細胞碎片等生物質(zhì)對床層穩(wěn)定性的影響,提出了一種量化表征方法,稱為生物質(zhì)脈沖響應(yīng)法[26-27]。通過檢測生物質(zhì)脈沖進入和離開擴張床的量,二者的比值定義為生物質(zhì)穿透指數(shù)(BTI),來衡量介質(zhì)對生物質(zhì)的吸附程度,BTI越小則說明生物質(zhì)在擴張床中的吸附越嚴重[28-30]。

        借鑒擴張床吸附研究中的生物質(zhì)脈沖響應(yīng)法,本文針對蛋白A親和介質(zhì)的非特異性吸附,建立量化表征方法,并以牛血清白蛋白(BSA)、畢赤酵母細胞培養(yǎng)液和CHO細胞培養(yǎng)液中雜蛋白作為典型雜質(zhì),考察不同類型的蛋白A親和介質(zhì)和兩種基質(zhì)微球的非特異性吸附,探討介質(zhì)非特異性吸附的相關(guān)機制,為新型蛋白A親和層析介質(zhì)的研發(fā)提供分析新方法和依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 主要材料與儀器

        主要試劑:BSA(等電點4.7,分子量66.7×103),生工生物工程(上海)股份有限公司;CHO細胞培養(yǎng)液,某生物技術(shù)公司。蛋白A親和層析介質(zhì)與基質(zhì)的相關(guān)信息匯總見表1,其中4FF和HW-65F分別為rProA介質(zhì)和HC-650F介質(zhì)所對應(yīng)基質(zhì)微球。

        表1 本文表征的Protein A親和層析介質(zhì)與基質(zhì)Table 1 Protein A affinity chromatography resins and matrices

        儀器:?KTAprime plus層析系統(tǒng)和Tricorn 5/200層析柱(5 mm×200 mm),GE Healthcare Life Sciences公司;電子切換閥(六通閥),KNAUER公司;One Drop OD-1000+分光光度計,南京五義科技有限公司;超濾離心管(10 kD),Merck公司。

        1.2 細胞培養(yǎng)液處理

        取畢赤酵母(Pichia pastorisGS115)或CHO細胞培養(yǎng)液在10000 r/min條件下離心15 min,得到上清液;0.22μm濾膜過濾,去除殘余的細胞碎片;過濾得到的培養(yǎng)液加入到10 kD超濾離心管中,在9000 r/min下離心30 min,以去除小分子物質(zhì),得到組分主要是大分子的細胞料液,作為典型的細胞培養(yǎng)雜質(zhì)。

        1.3 介質(zhì)非特異性吸附的定量表征

        1.3.1 定量表征方法Tricorn 5/200層析柱裝填介質(zhì)4 ml,柱徑為5 mm,柱高約20 cm。?KTAprime plus層析系統(tǒng)(GE Healthcare公司)與電子切換閥(KNAUER公司)連接,形成脈沖響應(yīng)法檢測系統(tǒng),具體見圖1。利用電子切換閥實現(xiàn)兩種狀態(tài)的液流轉(zhuǎn)換,從而檢測上樣脈沖在層析柱前和柱后的UV響應(yīng)。采用平衡緩沖液平衡系統(tǒng)和層析柱;上樣時,電子切換閥處于Inject狀態(tài),上樣一定量的料液,此時UV檢測器位于層析柱之前,280 nm波長檢測上樣的蛋白量;上樣后,電子切換閥轉(zhuǎn)換至Load狀態(tài),平衡緩沖液沖洗,此時UV檢測器處于層析柱之后,可以檢測料液經(jīng)層析柱后殘余的蛋白量。比較層析柱前后的蛋白量,可得到介質(zhì)對料液中蛋白的吸附量,定義介質(zhì)的非特異性吸附指數(shù)A為介質(zhì)吸附雜蛋白量與上樣雜蛋白量的比值,具體計算公式如下:

        圖1 介質(zhì)非特異性吸附定量表征方法示意圖Fig.1 Scheme of quantitative characterization method for non-specific adsorption of resin

        A值范圍為0~1,A值越大,表明介質(zhì)對雜質(zhì)的非特異性吸附作用越強。A=1,表明上樣雜質(zhì)完全被介質(zhì)吸附,非特異性吸附較嚴重;若A為0,則表明介質(zhì)對測定的雜質(zhì)基本沒有非特異性吸附。

        1.3.2 介質(zhì)非特異性吸附的測定方法 配制20 mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH 4.0和pH 5.0)、20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0)、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)和0.1 mol/L NaOH溶液。Tricorn 5/200層析柱裝填介質(zhì)4 ml,電子切換閥處于Inject狀態(tài),緩沖液平衡系統(tǒng)和層析柱,流速0.5 ml/min,不同pH緩沖液配制的料液上樣100μl,UV檢測出現(xiàn)響應(yīng)峰;當UV280nm響應(yīng)接近于基線,電子切換閥轉(zhuǎn)換至Load狀態(tài),用相應(yīng)緩沖液平衡沖洗,UV檢測出現(xiàn)響應(yīng)峰;直至UV280nm響應(yīng)再次接近基線,用0.1 mol/L NaOH溶液在0.3 ml/min流速下清洗再生,最后用平衡緩沖液再平衡。得到料液經(jīng)過層析柱前后的UV280nm響應(yīng)曲線面積,通過式(1)計算介質(zhì)的非特異性吸附指數(shù)A值。每個條件測試三次,取平均值。

        選擇A值較高的pH緩沖液加鹽配制不同濃度的NaCl溶液(0.1、0.25、0.5、1.0 mol/L),進一步考察不同鹽濃度條件下介質(zhì)對雜質(zhì)的非特異性吸附。每個條件測試三次,取平均值。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 脈沖響應(yīng)法測定條件優(yōu)化

        采用雜質(zhì)脈沖響應(yīng)法測定介質(zhì)的非特異性吸附,設(shè)定流速為0.5 ml/min,為保證足夠的停留時間便于后續(xù)實現(xiàn)液流轉(zhuǎn)換,選擇4 ml床層體積,柱高20 cm。實驗發(fā)現(xiàn)兩個操作因素對A值影響較大,分別為上樣蛋白濃度和上樣蛋白液量。保持上樣蛋白液量100μl(2.5%床層體積)不變,分別以不同濃度BSA溶液上樣,得到介質(zhì)非特異性吸附指數(shù)A值變化見圖2(a)。比較發(fā)現(xiàn),較高蛋白濃度上樣時,得到A值偏??;上樣濃度過低,柱后響應(yīng)峰過小,導(dǎo)致峰面積計算相對誤差較大。綜合比較,確定0.5 mg/ml為合適的上樣蛋白濃度。保持上樣蛋白濃度為0.5 mg/ml,考察不同蛋白上樣量的影響,結(jié)果如圖2(b)所示。結(jié)果表明,較高上樣量的A值偏??;而過小的液量上樣,柱后UV響應(yīng)峰過小,相對誤差較大。綜合考慮層析柱前后UV響應(yīng)峰面積相對值和柱后響應(yīng)面積大小兩個因素,選擇2.5%床層體積(100μl)作為合適的上樣蛋白液量。

        圖2 不同上樣蛋白濃度(a)和上樣蛋白液量(b)對A值測定的影響Fig.2 Effect of loading protein concentration(a)and protein solution volume(b)on the measurement of A

        2.2 不同介質(zhì)非特異性吸附比較

        選擇四種蛋白A親和介質(zhì),分別是兩種以瓊脂糖微球作為基質(zhì)的rProA和PrismA介質(zhì)、以聚甲基丙烯酸酯微球為基質(zhì)的HC-650F介質(zhì)和以聚乙烯醚微球為基質(zhì)的EA介質(zhì),在不同pH和鹽濃度下,以三種料液(BSA蛋白溶液、酵母細胞培養(yǎng)液和CHO細胞培養(yǎng)液)上樣,測定非特異性吸附指數(shù)A值,比較不同介質(zhì)對雜質(zhì)的非特異性吸附情況。

        2.2.1 介質(zhì)對BSA的非特異性吸附 以BSA蛋白溶液上樣,考察了不同蛋白A親和介質(zhì)的A值,溶液pH影響見圖3(a)。結(jié)果表明,四種介質(zhì)在酸性條件下的A值均高于中性和堿性條件,說明低pH時,四種介質(zhì)與BSA之間存在較強的相互作用。在pH 6~9條件下,以交聯(lián)瓊脂糖微球作為基質(zhì)的rProA和PrismA介質(zhì)的A值比較接近,推測rProA和PrismA介質(zhì)對BSA的吸附主要依賴其瓊脂糖微球基質(zhì)。以聚甲基丙烯酸酯作為基質(zhì)材料的HC-650F介質(zhì)在不同條件下的A值均偏高,表明該介質(zhì)對BSA的非特異性吸附較強。相比其他三種介質(zhì),以聚乙烯醚作為基質(zhì)的EA介質(zhì)的A值相對較小,表明EA介質(zhì)與BSA間的相互作用較弱,在中性或偏堿性條件下,幾乎沒有BSA結(jié)合。

        圖3 不同介質(zhì)和基質(zhì)微球?qū)SA吸附A值比較Fig.3 Comparison of the A value of BSA adsorption with different resins and matrix microspheres under different conditions

        在酸性條件下(pH 4或5),考察了添加鹽的影響,結(jié)果見圖3(b)。加鹽后rProA、PrismA和EA介質(zhì)的A值大幅減小,當NaCl達到0.25 mol/L后,A值基本不變,表明這三種介質(zhì)在低pH時與BSA之間可能同時存在靜電和疏水相互作用,加鹽屏蔽了部分靜電相互作用,導(dǎo)致A值有所下降。發(fā)現(xiàn)HC-650F介質(zhì)的A值幾乎不受鹽濃度影響,保持在1.0左右,表明該介質(zhì)可能主要通過疏水相互作用結(jié)合BSA。

        2.2.2 介質(zhì)對酵母細胞培養(yǎng)液中雜質(zhì)的非特異性吸附 以酵母細胞培養(yǎng)液上樣,四種介質(zhì)在不同條件下的A值見圖4。與BSA類似,四種介質(zhì)在酸性條件下的A值均高于中性或偏堿性條件,表明低pH條件促進介質(zhì)與酵母培養(yǎng)液中蛋白雜質(zhì)的結(jié)合。在pH 6~9時,以瓊脂糖微球為基質(zhì)的rProA和PrismA介質(zhì)以及聚乙烯醚為基質(zhì)的EA介質(zhì)測得的A值均小于0.1,表明這三種介質(zhì)在中性或偏堿性條件下幾乎不吸附酵母培養(yǎng)液中蛋白雜質(zhì),可作為親和吸附抗體的理想條件。以聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的HC-650F介質(zhì)在pH 6~9時的A值在0.25以上,與酵母細胞培養(yǎng)液中雜質(zhì)相互作用較強。pH 4時,加鹽后四種介質(zhì)的A值均有不同程度的降低,但當鹽濃度高于0.25 mol/L,A值維持穩(wěn)定,表明對于酵母細胞培養(yǎng)液中的蛋白雜質(zhì),四種介質(zhì)的吸附可能兼有靜電和疏水作用力,加鹽可在一定程度上降低介質(zhì)的非特異性吸附,但不能完全消除。

        圖4 不同介質(zhì)和基質(zhì)微球?qū)湍讣毎囵B(yǎng)液吸附A值比較Fig.4 Comparison of the A value of yeast broth adsorption with different resins and matrix microspheres under different conditions

        2.2.3 介質(zhì)對CHO細胞培養(yǎng)液中雜質(zhì)的非特異性吸附 以CHO細胞培養(yǎng)液上樣,不同條件下四種介質(zhì)的A值比較見圖5。與前文類似,四種介質(zhì)對雜質(zhì)均有一定吸附作用,且不同介質(zhì)存在差異。rProA介質(zhì)對CHO細胞培養(yǎng)液中雜質(zhì)的吸附作用較弱,且不受pH影響。以聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的HC-650F介質(zhì)在不同pH條件下的非特異性吸附均處于較高水平。PrismA和EA介質(zhì)在不同pH下測定的A值有較大差異,堿性條件可有效屏蔽PrismA和EA介質(zhì)與CHO細胞培養(yǎng)液中雜質(zhì)的相互作用。

        pH 4時,考察了添加鹽的影響,結(jié)果見圖5(b)??梢园l(fā)現(xiàn),加鹽后四種介質(zhì)的A值均有不同程度的降低。高鹽濃度(1.0 mg/ml)下,以瓊脂糖微球為基質(zhì)的rProA、PrismA介質(zhì)和以聚乙烯醚微球為基質(zhì)的EA介質(zhì)對CHO培養(yǎng)液中雜質(zhì)幾乎沒有吸附,雜質(zhì)結(jié)合可能主要基于靜電相互作用。對于聚甲基丙烯酸酯為基質(zhì)的HC-650F介質(zhì),即使在高鹽條件下,仍有一定量的雜質(zhì)吸附,表明可能存在一定程度的疏水結(jié)合。因此,以CHO細胞培養(yǎng)液上樣時,可通過添加鹽顯著減少rProA、PrismA和EA介質(zhì)對雜質(zhì)的吸附。

        圖5 不同介質(zhì)和基質(zhì)微球?qū)HO細胞培養(yǎng)液吸附A值比較Fig.5 Comparison of the A value of CHO broth adsorption with different resins and matrix microspheres under different conditions

        2.2.4 比較分析 比較不同料液上樣時四種蛋白A親和介質(zhì)的A值變化情況可知,介質(zhì)對雜質(zhì)有一定吸附作用,且不同介質(zhì)存在差異,這與文獻結(jié)果相似[10,31]。此外,對于不同料液,同一介質(zhì)的非特異性吸附也有所不同。

        (1)對于兩種以瓊脂糖微球作為基質(zhì)的rProA和PrismA介質(zhì),以BSA蛋白溶液和酵母細胞培養(yǎng)液上樣時,變化情況基本一致,即酸性條件下A值較大,在pH 6~9時對雜質(zhì)的吸附作用較小。同時,加鹽可有效降低A值,但鹽濃度增加至0.5 mol/L時,A值不會進一步降低,說明這兩種介質(zhì)對BSA和酵母雜質(zhì)的吸附可能兼有靜電和疏水作用力,且主要依賴于瓊脂糖微球的吸附作用。CHO細胞培養(yǎng)液上樣時,rProA介質(zhì)與雜質(zhì)的相互作用較小,幾乎不受pH影響,加鹽可大幅降低A值;PrismA介質(zhì)對雜質(zhì)的吸附作用相對偏高,隨pH增高而減弱,高鹽條件下,介質(zhì)對雜質(zhì)幾乎沒有吸附。說明兩種介質(zhì)對CHO雜質(zhì)的吸附主要基于靜電作用,且加鹽可有效屏蔽非特異性吸附。

        (2)以聚甲基丙烯酸酯微球作為基質(zhì)的HC-650F介質(zhì),在不同條件下的A值均高于其余三種介質(zhì),對雜質(zhì)表現(xiàn)出較強的吸附作用。以BSA蛋白溶液和酵母細胞培養(yǎng)液上樣時,酸性條件下HC-650F介質(zhì)與雜質(zhì)間的相互作用強于中性與堿性條件,然而介質(zhì)對CHO細胞培養(yǎng)液中雜質(zhì)的吸附作用幾乎不受pH影響。比較鹽濃度對A值影響可知,HC-650F介質(zhì)主要通過疏水作用吸附BSA蛋白,對酵母和CHO雜質(zhì)的吸附作用兼有靜電和疏水作用。

        (3)以聚乙烯醚微球作為基質(zhì)的EA介質(zhì),對三種料液中雜質(zhì)的吸附隨pH和鹽濃度變化趨勢與PrismA介質(zhì)相似。在中性或偏堿性條件下,EA介質(zhì)對BSA和酵母細胞培養(yǎng)液中雜質(zhì)幾乎沒有吸附,且加鹽可有效降低非特異性吸附,但鹽濃度增至0.25 mol/L時,A值不會進一步減少,說明EA介質(zhì)吸附雜質(zhì)兼有靜電和疏水作用。以CHO細胞培養(yǎng)液上樣時,介質(zhì)對雜質(zhì)的吸附作用相對較高,隨著pH升高而減小,且高鹽濃度下幾乎不吸附雜質(zhì),說明EA介質(zhì)與CHO雜質(zhì)主要通過靜電相互作用,高鹽或堿性條件可屏蔽非特異性吸附。

        2.3 介質(zhì)與基質(zhì)材料的非特異性吸附比較

        為探究基質(zhì)材料的影響,分別以rProA介質(zhì)及其瓊脂糖微球基質(zhì)4FF和HC-650F介質(zhì)及其聚甲基丙烯酸酯微球基質(zhì)HW-65F為典型代表,比較三種料液的非特異性吸附情況,結(jié)果見圖3~圖5。

        2.3.1 瓊脂糖4FF基質(zhì)BSA蛋白溶液和酵母細胞培養(yǎng)液上樣時,rProA介質(zhì)和4FF基質(zhì)的A值在低pH時較高,表明酸性條件下兩者的雜質(zhì)吸附作用較強。pH4或5時,兩者A值差異較大,推測低pH條件下rProA介質(zhì)的蛋白A配基與BSA和酵母料液中蛋白雜質(zhì)之間也有一定的相互作用,這與González-Valdez等[32]的研究結(jié)果相似。在中性和偏堿性條件下,兩者A值接近,說明rProA介質(zhì)對BSA和酵母料液中蛋白雜質(zhì)的非特異性吸附主要來源于其基質(zhì)4FF。對于CHO細胞培養(yǎng)液,所測pH范圍內(nèi)兩者的A值均比較相近,進一步證實該瓊脂糖基介質(zhì)的非特異性吸附主要依賴其基質(zhì)微球與雜質(zhì)間相互作用。加鹽后,介質(zhì)與基質(zhì)的A值均有不同程度的降低,表明雜蛋白結(jié)合兼有靜電和疏水作用。

        2.3.2 聚甲基丙烯酸酯HW-65F基質(zhì) 以三種料液上樣,在考察的pH范圍內(nèi),HC-650F介質(zhì)的A值顯著大于HW-65F基質(zhì),表明HC-650F介質(zhì)對雜質(zhì)蛋白的高吸附并非主要來自聚甲基丙烯酸酯基質(zhì)材料,可能配基與雜質(zhì)間存在一定的相互作用。加鹽后,HW-65F基質(zhì)的A值相應(yīng)降低,而HC-650F介質(zhì)的A值幾乎沒有變化,推測HC-650F介質(zhì)的親和配基與BSA之間存在較強的疏水相互作用,具體原因有待進一步深入探討。

        2.3.3 基質(zhì)材料的非特異性吸附比較 基質(zhì)是蛋白A親和介質(zhì)的重要組成部分,通過比較不同基質(zhì)材料的A值,有助于深入了解介質(zhì)非特異性吸附的作用機理。分析上述兩種基質(zhì)材料的結(jié)果可知:(1)對于三種料液,在中性或偏堿性條件下,兩種基質(zhì)材料的A值相近,表明兩者對雜質(zhì)的吸附作用大小接近。(2)BSA蛋白溶液和酵母細胞培養(yǎng)液上樣時,pH 4、加鹽后兩種基質(zhì)微球的A值相近,推測該條件下兩種基質(zhì)對BSA和酵母雜質(zhì)的疏水相互作用強度相似。(3)CHO細胞培養(yǎng)液上樣時,pH 4、加鹽后4FF基質(zhì)的A值大幅降低并保持在0.04左右,表明加鹽可有效屏蔽4FF基質(zhì)對CHO雜質(zhì)的吸附作用。但是,加鹽并未顯著降低HW-65F基質(zhì)的A值,說明該基質(zhì)可能通過疏水相互作用吸附CHO雜質(zhì)。

        3 結(jié) 論

        針對親和層析介質(zhì)非特異性吸附,建立了定量表征方法,優(yōu)化了操作條件,并以BSA、酵母發(fā)酵液和CHO細胞培養(yǎng)液作為典型蛋白雜質(zhì),考察了四種蛋白A親和介質(zhì)和兩種基質(zhì)微球的非特異性吸附。發(fā)現(xiàn)所測介質(zhì)和基質(zhì)對雜質(zhì)均存在一定的吸附作用,且不同介質(zhì)和基質(zhì)與不同雜質(zhì)間作用機制有所不同。中性或偏堿性條件下,四種介質(zhì)對雜質(zhì)的吸附作用相對較弱,酸性條件促進雜質(zhì)吸附。pH 6~9時,rProA、PrismA和EA三種介質(zhì)對BSA和酵母雜質(zhì)幾乎不吸附,HC-650F介質(zhì)對雜質(zhì)的吸附作用強于其余三種介質(zhì)。rProA介質(zhì)吸附雜質(zhì)主要依賴其基質(zhì)微球與雜質(zhì)間相互作用,HC-650F介質(zhì)與其基質(zhì)對雜質(zhì)的吸附作用大小有較大差異,推測其蛋白A配基與雜質(zhì)間存在一定的相互作用。結(jié)果表明,本文提出的定量表征方法切實可行,可用于考察親和層析介質(zhì)的非特異性吸附,探究介質(zhì)吸附雜質(zhì)的作用機制,為新型蛋白A親和層析介質(zhì)的研發(fā)提供分析新方法。

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