李倩，李曉霞，程麗琴，陳雙燕，齊冬梅，楊偉光，高利軍，新巴音，劉公社

（1.中國(guó)科學(xué)院植物研究所北方資源植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100093；2.山東省淄博第七中學(xué)，山東 淄博255000；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾161005）

CBF（C-repeat binding factor）基因是植物重要的抗逆基因，其屬于AP2/ERF（ethylene response factor）轉(zhuǎn)錄因子家族，AP2/ERF 可分為AP2、ERF 和RAV 三個(gè)亞家族［1］。ERF 包括CBF/DREB 和ERF 兩個(gè)亞家族，CBF/DREB 亞家族，只含1 個(gè)AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域。CBF 轉(zhuǎn)錄因子二級(jí)結(jié)構(gòu)的C 末端為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，富含酸性氨基酸。N 末端為核定位信號(hào)區(qū)，富含堿性氨基酸，中間區(qū)為AP2/EREBP 結(jié)構(gòu)域［2］。目前，CBF基因家族已經(jīng)在多種植物中得以研究，其中擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組中有6 個(gè)DREB1/CBF基因，即DREB1B/CBF1、DREB1C/CBF2、DREB1A/CBF3、DREB1D/CBF4、CBF5、CBF6［3-5］。1997年Stockinger 從擬南芥中首次克隆出CBF1基因［6］。Jaglo-Ottosen 等［7］研究表明擬南芥CBF1是與CRT/DRE 序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄激活因子，CBF1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)COR（cold-regulated）基因表達(dá)，提高了擬南芥的抗冷性。1998年Gilmour 等［3］利用探針從擬南芥中分離出CBF2和CBF3基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CBF1、CBF2和CBF3基因串聯(lián)布置在擬南芥基因組的4 號(hào)染色體的8.7 kb 區(qū)域，與CBF1一樣，CBF2和CBF3也受冷脅迫誘導(dǎo)，可與CRT/DRE 序列結(jié)合。2002年Haake 等［4］在擬南芥中獲得了CBF4基因，該基因受干旱誘導(dǎo)，不受低溫誘導(dǎo)。CBF4同樣激活CRT/DRE，這些下游基因參與冷和干旱響應(yīng)，轉(zhuǎn)基因擬南芥更耐冷和干旱脅迫。擬南芥CBF5 蛋白最初是由Maceluch 等［8］和Lermontova 等［9］克隆得到的，AtCBF5可能在RNA 加工中具有必不可少的作用。Magome 等［10］從擬南芥中分離出一種新的赤霉素（gibberellin，GA）缺陷型突變體ddf1。DDF在系統(tǒng)發(fā)育上接近DREB1/CBF基因，DDF1被高鹽脅迫誘導(dǎo)，過(guò)表達(dá)DDF1的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)高鹽度脅迫的耐受性增強(qiáng)，參與了GA 生物合成和脅迫耐受性的調(diào)節(jié)。擬南芥DDF2/CBF6是由鹽脅迫而不是由冷脅迫誘導(dǎo)的［11］，目前關(guān)于擬南芥CBF5和CBF6的報(bào)道較少。除擬南芥外，研究人員也對(duì)其他植物CBF基因進(jìn)行了研究。在小麥（Triticum aestivum）中，大多數(shù)CBF基因位于5 號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上，與耐冷基因具有緊密的聯(lián)系［12］。Choi 等［13］從大麥（Hordeum vulgare）中克隆了HvCBF3基因，其定位在5 號(hào)染色體上，位于抗寒?dāng)?shù)量性狀基因座的附近。Dubouzet 等［14］從水稻（Oryza sativa）中分離了5 組CBF基因，研究表明A-1 組基因由低溫誘導(dǎo)，而A-2 組基因由鹽和干旱誘導(dǎo)。過(guò)表達(dá)OsCBF基因的轉(zhuǎn)基因水稻的抗寒性、抗旱脅迫性、抗鹽性都得到提高［15］。葡萄屬（Vitis）的CBF4基因主要由冷誘導(dǎo)，CBF1，CBF2和CBF3基因?qū)Ω珊得{迫具有更好地響應(yīng)［16］。總之，在非生物脅迫條件下，轉(zhuǎn)錄因子CBF 可以識(shí)別下游COR基因啟動(dòng)子上的順式作用元件CRT/DRE，激活COR基因的表達(dá)，其參與冷、干旱、鹽等多種脅迫信號(hào)途徑，可提高植物抗逆性［17］。

羊草（Leymus chinensis）是禾本科多年生牧草及生態(tài)草，廣泛分布于歐亞草原的東部，是草原的優(yōu)勢(shì)種。其生態(tài)適應(yīng)范圍廣，抗逆性強(qiáng)，是天然的抗逆基因資源庫(kù)［18］。且其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、可再生能力強(qiáng)，能有效改良草原生態(tài)環(huán)境［19］。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，羊草與小麥和大麥具有密切的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系［20］。因此，關(guān)于羊草抗逆研究在草原修復(fù)和作物抗逆性提高等方面都具有重要價(jià)值。前期研究表明羊草的非生物脅迫響應(yīng)途徑主要有3 個(gè)：ABA、JA 和CBF 途徑［21］。其中CBF 途徑是擬南芥和水稻中的典型冷應(yīng)答途徑。本課題組前期已對(duì)抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了大量研究，結(jié)果表明LcDREB2a和LcMYB1基因可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗鹽性［22-23］。Li 等［24-25］從羊草中克隆獲得羊草鹽脅迫誘導(dǎo)新基因LcSAIN1和LcSAIN2，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)這兩個(gè)基因可提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)鹽脅迫的抗性。Gao 等［26］發(fā)現(xiàn)了一種新型的轉(zhuǎn)錄因子LcFIN1，其被冷脅迫誘導(dǎo)，可能參與冷脅迫的早期響應(yīng)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物的冷脅迫耐受性，LcCBF1與位于LcFIN1啟動(dòng)子區(qū)域的CRT/DRE 順式元件結(jié)合，LcFIN1受LcCBF1直接調(diào)節(jié)，而關(guān)于羊草CBF基因家族一直缺少系統(tǒng)的研究。本研究克隆得到羊草的CBF6（L.chinensisC-repeat binding factor 6）基因，將其轉(zhuǎn)入擬南芥中進(jìn)行功能驗(yàn)證，這為羊草CBF基因家族功能解析及牧草的抗逆分子機(jī)制提供重要的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

羊草材料種植地為中國(guó)科學(xué)院植物研究所羊草種質(zhì)資源圃（東經(jīng)116°12′，北緯39°59′）。羊草種子采用雙層濾紙法萌發(fā)，光照強(qiáng)度40 lx，相對(duì)濕度35%，溫度（28 ℃，12 h 晝）/（16 ℃，12 h 夜）中進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至5～6 cm 幼苗時(shí)，移栽至混合土（混合比例營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石為2∶1）中培養(yǎng)，材料收集時(shí)間為2018年。擬南芥野生型（ecotype Columbia，Col-0）種植于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)介質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土與蛭石（2∶1）混合土，溫度為23 ℃。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 材料處理 羊草LcCBF6基因的組織特異性表達(dá)模式分析：選取正常生長(zhǎng)8 周的耐鹽羊草種質(zhì)W3 和敏鹽羊草種質(zhì)S4，分別取根、葉、種子組織，液氮速凍，-80 ℃超低溫儲(chǔ)藏。鹽脅迫處理下羊草基因LcCBF6表達(dá)模式分析：選取正常生長(zhǎng)8 周的耐鹽羊草種質(zhì)W3 和敏鹽羊草種質(zhì)S4，進(jìn)行高鹽（200 mmol?L-1NaCl）處理4 h，取根和葉。同時(shí)，取200 mmol?L-1NaCl 處理4 h 的種子材料，液氮速凍，-80 ℃超低溫儲(chǔ)藏。

1.2.2 總RNA 提取和cDNA 合成 將羊草材料分別按照各自試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行處理，各處理取材料0.1 g，5 次重復(fù)。用多糖多酚植物RNA 提取試劑盒（華越洋，北京），提取各處理材料總RNA，并用DNaseI（Takara，Japan）消化DNA，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳和Biodropsis BD-2000 進(jìn)行RNA 質(zhì)量檢測(cè)。將提取出的RNA 使用PrimeScript?RT Reagent Kit 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系為10 μL：5×PrimeScript? Buffer（4 μL），PrimeScript? RT Enzyme Mix I（1 μL），Oligo dT Primer（1 μL），Random 6 mers（1 μL），Total RNA（1 μg），RNase-free dd H2O（up to 10 μL）。反應(yīng)條件：37 ℃30 min；85 ℃15 s，合成后的cDNA 存貯于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 基因克隆及載體構(gòu)建 通過(guò)檢索本課題組前期羊草鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得CBF6基因序列。將該序列在NCBI 上比對(duì)發(fā)現(xiàn)該序列為CBF家族基因，命名為L(zhǎng)cCBF6，根據(jù)其保守序列，用Primer 5 設(shè)計(jì)基因序列克隆引物：LcCBF6-F（GGACTGAATCGGAGGAAGAAGA），LcCBF6-R（GTGACCGTACAGCAGCACAAA），以cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)［27］。冰上配制反應(yīng)液，模板最終濃度為10～20 ng ? μL-1，混勻后離心，PCR反應(yīng)程序：95 ℃5 min；35 個(gè)循環(huán)（95 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，2 min）；72 ℃，2 min。PCR 反應(yīng)體系為20 μL：10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+Plus）（2 μL），dNTP Mixture（3.2 μL），cDNA（100 ng），Primer-F（0.6 μL），Primer-R（0.6 μL），LA Taq（0.2 μL），ddH2O（up to 20 μL）。取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠分離PCR 產(chǎn)物，將目的片段用膠回收試劑盒回收（上海生工），方法參照試劑盒說(shuō)明書。回收產(chǎn)物利用帶有酶切位點(diǎn)的引物：XbaI（TCTAGAATGTGTCCGATCAAGAAGG），SacI（GAGCTCCTAGCTAGCTGTGGTAGCT）進(jìn) 行PCR 擴(kuò)增，膠回收得到的序列即為帶有酶切位點(diǎn)的LcCBF6基因序列。

將上述膠回收產(chǎn)物連接到pMD19-T 克隆載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a，并進(jìn)行測(cè)序分析。用TaKaRa miniBEST 質(zhì)粒提取試劑盒分別提取pMD19-T-LcCBF6與pSN1301 質(zhì)粒，利用XbaI 和SacI 分別對(duì)pMD19-TLcCBF6和pSN1301 質(zhì)粒進(jìn)行酶切并連接，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書。

1.2.4LcCBF6基因生物信息學(xué)分析 通過(guò)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行LcCBF6基因及同源基因序列的搜索和比對(duì)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；使用DNAMAN 進(jìn)行多序列比對(duì)；使用ClustalX 2 和MEGA 6.0 進(jìn)行蛋白質(zhì)比對(duì)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建；使用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)LcCBF6進(jìn)行蛋白特性分析。

1.2.5LcCBF6基因表達(dá)分析 根據(jù)LcCBF6基因序列設(shè)計(jì)熒光定量引物為：LcACTIN-F（TGCTGACCGT ATGAGCAAAG），LcACTIN-R（GATTGATCCTCCGATCCAGA），LcCBF6-F（AGTCGTCCTCTTCCCCA GCG），LcCBF6-R（CGTAGTACAGGTCCCAGCCCAT），羊草Actin基因序列為內(nèi)參引物［24-25］。采用熒光定量PCR 方法，分析羊草LcCBF6在羊草不同組織（種子、根、葉）中NaCl 處理下的表達(dá)情況。定量PCR 體系和條件按照（TaKaRa LA Taq?，RR02MA，TaKaRa）試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，30 s；45 個(gè)循環(huán)（95 ℃，5 s；68 ℃，30 s）。定量PCR 反應(yīng)完成后，采使用2-ΔΔCt方法對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析［28］。

1.2.6 擬南芥轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性苗PCR 鑒定 將構(gòu)建好的融合載體pCAMBIA-3301-LcCBF6轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，采用花序侵染法［29］將處于花蕾期的野生型擬南芥的花序浸泡在侵染液中，保持1～2 min，侵染后以較高的濕度在培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24 h 后正常培養(yǎng)，直至擬南芥正常開花結(jié)果，收獲種子。將轉(zhuǎn)化后的擬南芥種子，用10%的次氯酸鈉進(jìn)行滅菌，將滅過(guò)菌的種子種植于含50 μg?mL-1潮霉素或卡那霉素（kanamycin，Kan）的固體MS 培養(yǎng)基上，并將經(jīng)過(guò)抗性篩選后仍然長(zhǎng)勢(shì)良好的擬南芥初步確定為陽(yáng)性苗。將陽(yáng)性幼苗移栽到土里繼續(xù)生長(zhǎng)，待其生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，提取葉片基因組DNA，用PCR 法進(jìn)一步鑒定，陽(yáng)性苗PCR 鑒定引物：LcCBF6-F（ATGTGTCCGATCAAG AAGGAG），LcCBF6-R（CTAGCTAGCTGTGGTAGTTCCA）。T1代種子種植后單株所收種子為T2代，理論上T2代應(yīng)該出現(xiàn)3∶1 的分離，選取T3代中的純合體株系進(jìn)行生物學(xué)試驗(yàn)分析。

1.2.7LcCBF6轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽分析 種子萌發(fā)階段耐鹽性試驗(yàn)：將3 個(gè)LcCBF6轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（Line1、Line2、Line5）和野生型擬南芥的種子播種在含有0，100，125，150 和200 mmol?L-1NaCl 的MS 培養(yǎng)基（MS 粉4.4 g，蔗糖30 g，瓊脂粉15 g，加水至1000 mL，pH 5.8）上。萌發(fā)溫度設(shè)置為23 ℃，每皿40 粒種子，3 次生物學(xué)重復(fù)，觀察種子的萌發(fā)情況，并統(tǒng)計(jì)綠色子葉數(shù)和鮮重。鹽脅迫根長(zhǎng)抑制試驗(yàn)：將LcCBF6轉(zhuǎn)基因擬南芥3個(gè)株系（Line1、Line2、Line5）及野生型擬南芥的種子分別播種在MS 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4 d 后，將其幼苗移栽到含有0，100，125，150 和200 mmol?L-1NaCl 的MS 培養(yǎng)基上，3 次生物學(xué)重復(fù)，斜放培養(yǎng)基，1 周后測(cè)量根長(zhǎng)。幼苗抗鹽試驗(yàn)：將LcCBF6轉(zhuǎn)基因與野生型擬南芥種子在MS 培養(yǎng)基萌發(fā)7 d 后，將長(zhǎng)出的幼苗分別移栽到含有0，100，125，150 和200 mmol?L-1NaCl 的MS 培養(yǎng)基上。繼續(xù)培養(yǎng)3 周后，觀測(cè)幼苗的生長(zhǎng)狀況并統(tǒng)計(jì)其存活率和鮮重，3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 和SPSS 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Microsoft Excel 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊草LcCBF6 基因的克隆及結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)

依據(jù)基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)引物，從羊草中克隆得到LcCBF6基因，該基因開放閱讀框（open reading frame，ORF）為738 bp。使用ProtParam 對(duì)LcCBF6 進(jìn)行蛋白特性分析，發(fā)現(xiàn)LcCBF6ORF 編碼245 個(gè)氨基酸，分子量為26 kD，等電點(diǎn)（isoelectric point，PI）為6.45。NCBI 序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)LcCBF6 存在大量相似蛋白，均含有保守的AP2 結(jié)構(gòu)域，屬于該家族轉(zhuǎn)錄因子。LcCBF6 與蒙古冰草（Agropyron mongolicum）CBF6 蛋白同源性最高，為92%，其次與兩芒山羊草（Aegilops biuncialis）CBF6 蛋白的同源性為90%，與山羊草（Triticum triunciale）CBF6蛋白的同源性為88%，與黑麥（Secale cereale）、小麥、大麥和黑麥草（Lolium perenne）的CBF6 蛋白的同源性分別為91%、88%、91%、76%（圖1）。利用MEGA 構(gòu)建了LcCBF6 及其同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)羊草LcCBF6 在進(jìn)化上與小麥、大麥、蒙古冰草、黑麥和山羊草的親緣關(guān)系較近（圖2）。

圖1 LcCBF6 基因編碼蛋白序列比對(duì)分析Fig.1 Sequence alignment analysis of LcCBF6 gene coding protein

圖2 LcCBF6 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 LcCBF6 phylogenetic tree

2.2 羊草基因LcCBF6 的表達(dá)模式分析

組織特異性分析結(jié)果表明，LcCBF6基因在羊草的種子、葉、根中的表達(dá)存在差異，根中表達(dá)量最高，種子次之，葉中最低。耐鹽性不同的兩種羊草種質(zhì)中LcCBF6的表達(dá)量存在差異，該基因在耐鹽種質(zhì)W3 的表達(dá)量高于敏鹽種質(zhì)S4（圖3A），推測(cè)羊草LcCBF6基因與植物耐鹽性相關(guān)。

對(duì)羊草敏鹽種質(zhì)S4 和耐鹽種質(zhì)W3 進(jìn)行200 mmol?L-1NaCl處理4 h 后，分別提取種子、葉、根的RNA，對(duì)不同組織中LcCBF6的表達(dá)模式進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明在鹽脅迫下，種子和葉片中LcCBF6基因均上調(diào)，但耐鹽種質(zhì)W3 的上調(diào)倍數(shù)大于敏鹽種質(zhì)S4。根中敏鹽種質(zhì)S4 的LcCBF6基因上調(diào)，耐鹽種質(zhì)處理前后差異不顯著（圖3B）。這表明LcCBF6基因受鹽誘導(dǎo)表達(dá)，且不同耐鹽性種質(zhì)中的表達(dá)存在差異，推測(cè)該基因可能參與植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)。

圖3 LcCBF6 基因的表達(dá)模式Fig.3 Expression patterns of LcCBF6 gene

2.3 鹽脅迫對(duì)過(guò)表達(dá)LcCBF6 擬南芥種子萌發(fā)的影響

為了進(jìn)一步明確LcCBF6的基因功能，本研究構(gòu)建了雙子葉植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-LcCBF6（圖4A），并進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)化，在獲得的轉(zhuǎn)基因株系中，選取3 個(gè)株系（Line1、Line2 和Line5，圖4B）的T3代純合體種子對(duì)鹽脅迫下的萌發(fā)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明萌發(fā)期鹽脅迫對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的綠色子葉數(shù)和鮮重均產(chǎn)生影響。但與野生型植株比較，這種生長(zhǎng)抑制在LcCBF6轉(zhuǎn)基因植株中表現(xiàn)較輕。在125 mmol?L-1NaCl 處理下，野生型植株的綠色子葉率為16%，3 個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的綠色子葉率分別為30%、52%和50%。測(cè)定植株鮮重發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照條件下，轉(zhuǎn)基因和野生型鮮重沒(méi)有顯著差異。但是，在125 mmol?L-1NaCl 處理下，野生型鮮重為26.66 mg·10 plant-1，3 個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥的鮮重分別為41.66、57.33 和51.33 mg·10 plant-1。即在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的綠色子葉數(shù)和鮮重均顯著高于野生型（圖5）。

圖4 植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-LcCBF6 酶切鑒定及轉(zhuǎn)基因株系PCR 鑒定Fig.4 Identification of plant expression vector pCAMBIA3301-LcCBF6 by enzyme digestion and PCR identification of transgenic line

圖5 NaCl 脅迫對(duì)LcCBF6 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)的影響Fig.5 Effects of LcCBF6-over-expressing Arabidopsis seed germination under NaCl stress（mean±SD，n=3）

2.4 鹽脅迫對(duì)LcCBF6 過(guò)表達(dá)擬南芥幼苗期的影響

進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥幼苗期耐鹽性進(jìn)行比較。將在MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d 的轉(zhuǎn)LcCBF6基因和野生型擬南芥幼苗移栽到含有不同NaCl（0～200 mmol?L-1）的培養(yǎng)基上，選擇長(zhǎng)勢(shì)相同的擬南芥幼苗移苗，3 周后觀察生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，在無(wú)NaCl 處理的情況下轉(zhuǎn)基因和野生型株系生長(zhǎng)狀況較好；但在150 mmol?L-1NaCl 處理下，野生型植株大部分枯萎，轉(zhuǎn)基因植株大部分仍然存活（圖6）。

存活率統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)150 mmol?L-1NaCl 處理3 周后野生型存活率為47.22%，LcCBF6三個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系存活率分別為86.11%、91.66%和83.33%。200 mmol?L-1NaCl 處理下，野生型存活率為5.56%，而LcCBF6轉(zhuǎn)基因擬南芥3 個(gè)株系的存活率分別為55.56%、36.11%和41.67%。同時(shí)，每個(gè)處理取10 株幼苗統(tǒng)計(jì)其鮮重，發(fā)現(xiàn)150 mmol?L-1NaCl 處理下，野生型的鮮重為238 mg·10 plant-1，而3 個(gè)LcCBF6轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的鮮重分別為311、302 和384 mg·10 plant-1。200 mmol?L-1NaCl 處理下，野生型擬南芥鮮重為99 mg·10 plant-1，而3 個(gè)轉(zhuǎn)LcCBF6基因植株鮮重分別為170、223 和178 mg·10 plant-1（圖6）。這表明LcCBF6轉(zhuǎn)基因株系幼苗期耐鹽性顯著高于野生型，即LcCBF6基因可以增強(qiáng)幼苗期擬南芥的耐鹽性。

圖6 轉(zhuǎn)LcCBF6 基因擬南芥幼苗抗鹽表型Fig.6 Salt-resistant phenotype of LcCBF6-over-expressing Arabidopsis in seedlings stage（mean±SD，n=3）

2.5 轉(zhuǎn)LcCBF6 基因提高鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)

為了研究鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥根系的影響，將擬南芥幼苗移栽到含有0～200 mmol?L-1NaCl 的培養(yǎng)基中，斜放培養(yǎng)皿，生長(zhǎng)7 d 后測(cè)量根的伸長(zhǎng)率。發(fā)現(xiàn)野生型和轉(zhuǎn)基因植株在對(duì)照條件下根長(zhǎng)沒(méi)有顯著差異。但是，150 mmol?L-1NaCl 脅迫后野生型擬南芥植株根長(zhǎng)僅為13 mm，而轉(zhuǎn)LcCBF6基因植株3 個(gè)株系的根長(zhǎng)分別為15、20 和24 mm（圖7），這說(shuō)明轉(zhuǎn)LcCBF6基因減輕了鹽脅迫對(duì)擬南芥根長(zhǎng)的抑制作用。

圖7 NaCl 脅迫對(duì)LcCBF6 轉(zhuǎn)基因擬南芥根長(zhǎng)影響Fig.7 Effects of NaCl stress on root length of LcCBF6-over-expressing Arabidopsis plants（mean±SD，n=3）

3 討論

逆境脅迫對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量和生態(tài)環(huán)境造成極大的威脅，牧草植物對(duì)外界環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，因此挖掘牧草植物抗逆基因，分析其抗逆機(jī)制已經(jīng)成為當(dāng)下的研究趨勢(shì)［30］。CBF 轉(zhuǎn)錄因子，也稱為DREB1 蛋白，是植物抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明CBF 轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別CRT/DRE 順式作用元件，只含1 個(gè)AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域，含有保守CCGAC 序列，當(dāng)植物受到低溫脅迫后，CBF基因迅速激活下游COR基因。目前已經(jīng)在許多植物物種中分離出CBF基因，例如擬南芥［2］、大豆（Glycine max）［31］、番茄（Lycopersicon esculentum）［32］、小麥［11］、大麥［12］和玉米（Zea mays）［33］等。在擬南芥中，CBF1、CBF2和CBF3主要參與冷脅迫相關(guān)途徑，CBF4參與冷和干旱響應(yīng)途徑，CBF5和CBF6主要受高鹽脅迫誘導(dǎo)［10-11］，這表明擬南芥CBF基因家族存在功能分化［34］。而羊草是草甸草原的建群種，抗逆性強(qiáng)，具有優(yōu)越的草地生產(chǎn)性能，因此對(duì)羊草抗逆基因資源方面的研究意義重大［35］。本研究對(duì)羊草CBF6基因進(jìn)行克隆及分析，結(jié)果表明，LcCBF6含有保守的AP2 結(jié)構(gòu)域，屬于CBF基因家族，與小麥CBFFIIIa-6.1基因同源性為88%（圖1）。有研究表明CBFIIIa-6.1在冬季小麥品種中表達(dá)量高，并且受冷脅迫誘導(dǎo)［36］。同時(shí)LcCBF6與大麥HvCBF6基因同源性為91%，研究發(fā)現(xiàn)HvCBF6對(duì)冷處理延遲響應(yīng)，在冷處理8 h 后首次檢測(cè)到，并在24 h 達(dá)到峰值，HvCBF6激活COR基因在無(wú)冷脅迫（即溫暖）條件下的表達(dá)［37］。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)羊草LcCBF6在進(jìn)化上與小麥、大麥親緣關(guān)系較近（圖2）。因此，推斷LcCBF6基因功能可能與CBFIIIa-6.1、HvCBF6具有相似性，參與植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)。

前期研究表明，羊草CBF基因家族基因的表達(dá)具有組織特異性，其中LcDREB3a在葉中表達(dá)量最高，其次是橫走根莖和根，在葉鞘中的表達(dá)量最低［38］。而本研究發(fā)現(xiàn)LcCBF6基因在根中表達(dá)量最高，種子中表達(dá)量次之，葉中表達(dá)量最低，這表明羊草CBF基因家族不同基因的組織表達(dá)情況存在差異。此外，前人研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtCBF6在鹽脅迫下，影響赤霉素（gibberellin，GA）的表達(dá)水平，導(dǎo)致侏儒癥和延遲開花等［11］。而本研究表明耐鹽性不同的兩種羊草種質(zhì)中LcCBF6的表達(dá)量存在差異，耐鹽種質(zhì)W3 的LcCBF6基因表達(dá)量高于敏鹽種質(zhì)S4。同時(shí)，在鹽脅迫條件下，種子和葉片中LcCBF6基因均上調(diào)，且耐鹽種質(zhì)W3 的基因上調(diào)倍數(shù)大于敏鹽種質(zhì)S4；根中敏鹽種質(zhì)S4 鹽脅迫后LcCBF6基因上調(diào)，耐鹽種質(zhì)W3 處理前后LcCBF6基因差異不顯著（圖3）。上述結(jié)果表明該基因受鹽誘導(dǎo)表達(dá)，并且可能與羊草耐鹽性相關(guān)。

Zhang 等［32］從番茄中克隆到了LeCBF1～LeCBF3（L.esculentum CBF1-3）基因，其中LeCBF1參與冷脅迫響應(yīng)。Qin 等［33］使用酵母單雜交技術(shù)分離玉米的ZmDREB1A基因，ZmDREB1A受冷和高鹽脅迫誘導(dǎo)，可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱和抗凍能力。Xiao 等［39］從野葡萄（Vitis riparia）和栽培葡萄（Vitis vinifera）中分離出CBF1～CBF3基因，研究表明寒冷、干旱和外源脫落酸（abscisic acid，ABA）均能誘導(dǎo)葡萄CBF基因的表達(dá)。Kidokoro 等［31］從大豆中鑒定出14 種GmDREB1s，GmDREB1 激活GmPYL21的表達(dá)，不依賴ABA途徑增強(qiáng)ABRE 介導(dǎo)的基因表達(dá)，激活HSF，再激活HSP 參與植物耐熱途徑，GmDREB1基因在提高植物耐熱性和抗旱性中發(fā)揮重要作用。這些結(jié)果表明CBF 途徑不僅在參與植物抗冷調(diào)節(jié)，在干旱和鹽堿脅迫途徑中也發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)LcCBF6可以顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗鹽性，表明LcCBF6基因可能參與植物對(duì)鹽脅迫響應(yīng)，提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性（圖5～7），這與前人研究的擬南芥CBF6基因功能具有一定的相似性［11］。本研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了羊草抗性基因資源，為牧草及重要農(nóng)作物的抗逆分子育種提供了優(yōu)異基因資源。