楊凱，史娟，袁玉濤，王立婷

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川750021）

白三葉（Trifolium repens）屬于豆科（Leguminosae）三葉草屬（Trifolium），原產(chǎn)于歐洲和北非，是我國廣泛栽培應(yīng)用的優(yōu)質(zhì)豆科牧草之一［1-2］，常見的野生種有白三葉、紅三葉（Trifolium pratense）、草莓三葉草（Trifolium fragiferum）和野火球（Trifolium lupinaster）4 種［3-4］。三葉草生態(tài)適宜性強(qiáng)，在改善國內(nèi)外城鎮(zhèn)土壤有機(jī)質(zhì)、培肥地力、綠化和水土保持等方面發(fā)揮著重大作用［5］，因其營養(yǎng)物質(zhì)豐富、適口性好、品質(zhì)優(yōu)良，已成為反芻動(dòng)物的重要飼料來源［6-8］。目前，國家致力于農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)改革和草畜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，三葉草因其品質(zhì)優(yōu)良、觀賞性強(qiáng)被廣泛種植。

白粉病是牧草生產(chǎn)過程中的主要真菌病害。豆科、禾本科屬的多種牧草均可被白粉菌侵染［9］，白粉菌侵染不僅使牧草光合速率下降，葉片早枯，且對牧草的品質(zhì)及產(chǎn)量產(chǎn)生一定影響，在我國新疆、吉林、江蘇等地均有報(bào)道［10］。楊芬［11］以有性階段的閉囊殼和無性孢子特征，將新疆園林草坪三葉草白粉病病原無性時(shí)期鑒定為半知菌亞門粉孢屬（Oidium），有性時(shí)期為子囊菌亞門白粉菌屬（Erysiphe）；桑維均等［12］研究表明貴陽地區(qū)紅三葉草白粉病以菌絲體和分生孢子在植株上越冬、越夏，成為來年侵染源，但未發(fā)現(xiàn)有性世代。袁玉濤等［13］依據(jù)分生孢子和閉囊殼形態(tài)特征，明確了寧夏地區(qū)紫花苜蓿（Medicago sativa）白粉病病原為蓼白粉菌（Erysiphe polygoni）。李帥等［14］研究番茄（Lycopersicon esculentum）白粉病病原，因未發(fā)現(xiàn)閉囊殼，利用無性態(tài)分生孢子特征及分子鑒定法明確了黑龍江省番茄白粉病病原種類。寧夏氣候干旱，白三葉草作為重要的園林綠化草種，白粉病發(fā)生逐年加重，有關(guān)致病菌的分類地位目前尚不明確，因此，明確寧夏地區(qū)白三葉草白粉病病原菌的種類，可為指導(dǎo)防控提供依據(jù)。

植物病原真菌順利侵入寄主進(jìn)而建立寄生關(guān)系是發(fā)病的基礎(chǔ)。當(dāng)病原菌侵入寄主時(shí)，通常會(huì)產(chǎn)生一些侵染結(jié)構(gòu)，如附著胞、侵染釘?shù)葋韼椭秩?，對于專性寄生型真菌，通常以吸器進(jìn)入寄主細(xì)胞獲得營養(yǎng)，并與寄主建立寄生關(guān)系［15］。白粉菌是典型的活體營養(yǎng)型真菌，在植物體內(nèi)以吸器的形成標(biāo)志和寄主建立寄生關(guān)系［16］。任斌等［17］使用光學(xué)顯微鏡及透射電鏡觀察了葉枯病菌侵染蘋果（Malus domestica）葉片的發(fā)育情況及侵染過程，研究表明接種9 h 分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管且附著胞形成，1 d 后芽管頂部形成次級分生孢子，2 d 后次級分生孢子萌發(fā)形成附著胞，3 d 后附著胞演變?yōu)榍秩踞斍秩爰闹?，表皮?xì)胞內(nèi)可見初生及次生菌絲形成且葉片顯癥。楊若林等［18］通過半薄及超薄切片觀察了白粉菌侵染小麥（Triticum aestivum）葉片細(xì)胞的顯微及超微結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)受感染小麥葉片細(xì)胞細(xì)胞壁沉積大量團(tuán)狀電子致密顆粒，線粒體膜解體，葉綠體由橢圓形變?yōu)閳A形。研究結(jié)果對于解析寄主感病引起的病理變化以及深入揭示病原菌的侵入機(jī)制提供了重要的細(xì)胞學(xué)證據(jù)。為了揭示白三葉草白粉病菌侵入寄主及其引起的細(xì)胞病理學(xué)特征，本研究對白粉病菌的生物學(xué)特性以及白粉菌侵染寄主的組織病理學(xué)特征進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白三葉草種子由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院牧草分子育種研究室提供。

白三葉草白粉病菌菌株：來源于寧夏銀川市綠化地自然感染白粉病的白三葉草上，以BF 表示。

1.2 主要化學(xué)試劑

真菌DNA 提取試劑盒（Biospin?Fungus Genomic DNA Extraction Kit）購于BioFlux 公司；2×EcoTaq?PCR SuperMix（+dye）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；水合氯醛和三氯乙酸購于博奧生物集團(tuán)有限公司；乙醇、氯仿和苯胺藍(lán)購于天津大茂化學(xué)試劑有限公司。

1.3 白三葉草的培育、白粉病菌的繁殖及接種方法

1.3.1 白三葉草的培育 2018年6月采用盆栽法培育白三葉草。將無菌基質(zhì)土（基質(zhì)∶土=1∶1）拌水，裝入10盆直徑為15 cm 的花盆中1/2 處，選飽滿的白三葉草種子在55 ℃恒溫水中浸泡2 h 以催芽，均勻地播撒在花盆中，覆基質(zhì)土1 cm，澆透水，用保鮮膜保濕，置于RQX-250 智能人工氣候箱（上海甄明科學(xué)儀器有限公司，中國）培育，培育條件設(shè)定為：溫度25 ℃、14 h/10 h 光暗交替4000 lx、濕度75%，出苗后去掉保鮮膜，正常管理，長至四葉一心時(shí)進(jìn)行接種。

1.3.2 白粉病菌的繁殖 采集新鮮的BF 菌株，接種于盆栽培養(yǎng)的健康白三葉草葉片上，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。促其產(chǎn)生大量白粉層，作為接種菌源。

1.3.3 接種方法 采用震動(dòng)抖落法接種［13］。采集長滿新鮮白粉菌的白三葉草葉片，置于被接種白三葉草葉片上方4～7 cm 處，輕輕震動(dòng)，使白粉菌均勻落在被接種葉片，5 min 后在接種葉片上方噴霧。

1.4 病原菌在寄主表面的萌發(fā)特征及侵染寄主的超微結(jié)構(gòu)觀察

1.4.1 白粉菌侵染白三葉草表面癥狀觀察 按照1.3.3 方法進(jìn)行。于接種后每隔1 d 觀察1 次。觀察葉片顯癥和病斑擴(kuò)展的時(shí)間。

1.4.2 白粉菌在白三葉草表面萌發(fā)特征觀察 采用葉片透明法［19］，將接菌的葉片每隔3～4 h 取樣置于脫色液中脫色24 h 后倒掉脫色殘余物換為透明液，24 h 后取出透明好的葉片使用苯胺藍(lán)染色液染色5 min 后觀察，使用BX53 顯微鏡（奧林巴斯株式會(huì)社，日本）觀察分生孢子、芽管、附著胞、菌絲及分生孢子梗的形態(tài)和大小，并測量拍照做好記錄。

1.4.3 透射電鏡樣品的制備和觀察 參照康振生［20］的方法制備樣品。將制備好的樣品在解剖鏡下進(jìn)行修塊，在EM KMR3 超薄切片機(jī)（Leica 公司，德國）上切片，用1%甲苯胺藍(lán)染色液染色，經(jīng)流動(dòng)水沖洗染色液并烤干，在顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照。利用半薄切片進(jìn)行樣品定位，超薄切片經(jīng)2%醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色并晾干，使用1200 EX 透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社，日本）觀察并拍照。

1.5 病原菌形態(tài)特征觀察

采用光學(xué)顯微鏡直接觀察。滴一滴無菌水于載玻片上作為浮載劑，將白粉菌抖落在載玻片上，蓋上蓋玻片，在BX53 顯微鏡（奧林巴斯株式會(huì)社，日本）下觀測病原菌形態(tài)特征。

1.6 病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.6.1 樣品DNA 的提取 采用單斑繁殖純化白粉病菌，反復(fù)多次培養(yǎng)獲得生長一致的白粉病菌菌落，用滅菌手術(shù)刀片輕輕刮取葉片表層菌絲，稱取0.1 g 白三葉草白粉菌菌絲，使用真菌DNA 提取試劑盒［Biospin?Fungus Genomic DNA Extraction Kit（BioFlux 公司）］提取白三葉草白粉病病菌菌絲體DNA［21］，使用Simpli Nano 超微量分光光度計(jì)（GE 公司，美國）測定濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 引物選擇與PCR 擴(kuò)增 使用rDNA-ITS 通用引物序列ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對提取的白三葉草白粉病菌菌絲體DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：2×PCR Mix 12.5 μL、DNA 模板1 μL，ITS1 引物0.5 μL、ITS4 引物0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共設(shè)置35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照后，回收產(chǎn)物交由昆泰銳（武漢）生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。將菌株測序所得的序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.gov）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 同源性比對，基于GenBank 中報(bào)道的相關(guān)病原菌的序列信息豌豆白粉菌（Erysiphe pisi）（登錄號為KY661145.1 和KY661137.1），采用鄰接法（neighbor-joining method），通過Mega 5.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展重復(fù)數(shù)為1000 次。確定白粉病菌菌株的分類地位。

1.7 分生孢子生物學(xué)特性觀察

設(shè)溫度、pH 和光照3 個(gè)處理。其中溫度梯度處理為5、10、15、20、25、28 和30 ℃；pH 值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0；光照處理為全黑暗、12 h 光照×12 h 黑暗交替、全光照。

采用水瓊脂玻片法［22］觀察。每個(gè)處理3 次重復(fù)，置于RQX-250 智能人工氣候箱（上海甄明科學(xué)儀器有限公司，中國）培養(yǎng)，分別于4、6、8、12 和24 h 觀察。觀察分生孢子的萌發(fā)，計(jì)算萌發(fā)率，每重復(fù)觀察統(tǒng)計(jì)3 個(gè)視野，每視野觀察到的孢子個(gè)數(shù)≥100 個(gè)。

萌發(fā)率（%）=分生孢子的萌發(fā)個(gè)數(shù)/視野內(nèi)總孢子數(shù)×100

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0 進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan 多重比較進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 白粉菌侵染白三葉草葉片癥狀觀察

接種后第4 天，葉片表面顯癥，出現(xiàn)稀疏的白粉層（圖1B）；第5 天，白粉層逐漸加厚并開始擴(kuò)展（圖1C）；第6 和7 天，粉斑擴(kuò)展至葉片的1/3～2/3（圖1D，E）；第10 天，粉層覆蓋率達(dá)到90%以上，粉層加厚，此時(shí)葉片出現(xiàn)卷曲（圖1F）；15～20 d，整個(gè)葉片粉層加厚，葉片變黃，萎蔫，并逐漸枯落（圖1G，H），但始終沒有觀察到閉囊殼。由4 d顯癥至15 d 布滿整個(gè)葉片大約需要11 d，通過比葉重法測定葉片面積，得到菌絲生長速率為34.47 mm2·d-1。

圖1 白粉病菌危害白三葉草葉片癥狀Fig.1 Symptoms of leaf damage of T.repens by E.pisi

2.2 分生孢子在葉片表面的萌發(fā)特性觀察

在25 ℃條件下，接種在葉片上的分生孢子，4 h 時(shí)開始萌發(fā)，在分生孢子頂端肩胛處長出初生芽管（圖2A），10 h 后芽管頂端膨大，形成橢圓形或球形的附著胞（圖2B）；部分孢子另一側(cè)肩胛亦可萌發(fā)產(chǎn)生初生芽管，形成長圓形的附著胞（圖2D），12 h 后附著胞與葉面接觸一側(cè)或頂端萌發(fā)形成侵染釘（圖2C），并開始侵入葉片組織，有的分生孢子另一端肩胛處萌發(fā)長出芽管，芽管生長到一定長度侵入組織獲取營養(yǎng)，形成拱狀菌絲，每個(gè)拱狀菌絲基部（圖2C-Rt）侵入寄主組織產(chǎn)生吸器；24 h 分生孢子芽管基部直接長出初生菌絲（圖2D），隨著初生菌絲的生長，分生孢子逐漸由飽滿變?yōu)楸庑?，此時(shí)芽管生長所需的營養(yǎng)由分生孢子提供；48 h 后各菌絲形成分枝，產(chǎn)生次生菌絲（圖2E），表明白粉菌開始通過吸器吸收營養(yǎng)，亦表明白粉菌和寄主成功建立寄生關(guān)系；96 h 后，大量菌絲網(wǎng)狀交織（圖2F），此時(shí)葉片表面已經(jīng)開始顯癥，可以觀察到白色粉層；144 h 后菌絲層變厚，顯微觀察菌絲每隔51.79～77.68 μm 形成一個(gè)直立的孢子梗（圖2G）；孢子梗繼續(xù)生長，168 h 后，每個(gè)孢子梗串生2～3 個(gè)分生孢子，向基性成熟脫落（圖2H），解剖鏡下觀察分生孢子梗排列整齊，長度基本一致（圖2I）。

圖2 白粉病菌在白三葉草葉片的發(fā)育情況Fig.2 Development of E.pisi in T.repens

2.3 白三葉草感染白粉病菌的組織病理變化和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

觀察初顯癥（接種白粉菌4 d）白三葉草葉片的組織切片（圖3B），清晰看到葉片表皮細(xì)胞表面附著大量的菌絲（Hp），且菌絲已經(jīng)侵入寄主的表皮細(xì)胞形成吸器（Hs），表明此時(shí)白粉病菌已經(jīng)通過吸器吸收寄主營養(yǎng)供菌絲生長，而在柵欄組織和海綿組織均未觀察到侵入菌絲。正常的白三葉草組織結(jié)構(gòu)完整（圖3A），柵欄細(xì)胞排列整齊，海綿細(xì)胞排列緊密，維管束發(fā)達(dá)；而受到白粉病菌侵染的柵欄組織和海綿組織細(xì)胞排列疏松，且維管束萎縮，但是整體結(jié)構(gòu)尚完整，表明侵染早期，白粉病菌對寄主組織結(jié)構(gòu)的破壞性較小。

圖3 正常白三葉草寄主組織與受白粉病菌侵入寄主組織的半薄切片F(xiàn)ig.3 A semi-thin section of normal T.repens host tissue and powdery mildew invaded the host tissue

超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，白粉病菌菌絲內(nèi)含有細(xì)胞核（Nu）、大液泡（Bv）、囊泡（Ve）、線粒體（Mi）和核糖體（Ri），部分線粒體及多個(gè)囊泡排列于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)側(cè)（圖4A，B），菌絲一側(cè)形成凸起進(jìn)行延長生長且頂端邊緣具有膜性物（圖4A，C）；菌絲有隔且內(nèi)有大量的液泡聚集，細(xì)胞核臨近菌絲頂端（圖4D，E），分析可能是隨著菌絲生長，大量液泡產(chǎn)生壓力將細(xì)胞核和線粒體推向菌絲頂部；同時(shí)觀察到白粉菌菌絲侵入寄主前，與寄主接觸部位的表皮細(xì)胞細(xì)胞壁加厚，顏色加深，對應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)側(cè)略凹陷（圖4F），寄主響應(yīng)病原菌侵染形成的此種結(jié)構(gòu)可能是細(xì)胞壁抵御病菌侵入產(chǎn)生的反應(yīng)，也可能是病原菌侵入誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生的反應(yīng)。菌絲通過保衛(wèi)細(xì)胞和表皮細(xì)胞交界處，以直接侵入方式侵入寄主細(xì)胞壁，侵入寄主細(xì)胞壁組織的菌絲頂端膨大，中間有一近圓形的電子致密度高的區(qū)域，該區(qū)域向菌絲頂端輻射分布多個(gè)小的囊泡和顆粒狀物，被侵染的寄主細(xì)胞壁組織被降解，且顏色加深，鄰近的氣孔通道變形，保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生質(zhì)膜分離現(xiàn)象（圖4G），但并未觀察到侵入結(jié)構(gòu)。與侵入菌絲對應(yīng)的表皮細(xì)胞內(nèi)側(cè)形成電子致密度較高的胞壁沉積物，細(xì)胞壁和質(zhì)膜不再完整（圖4H，I），而表皮細(xì)胞內(nèi)的胞壁沉積物可能是病原菌誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白，也可能是寄主的病理反應(yīng)；同時(shí)還觀察到表皮細(xì)胞內(nèi)形成了吸器（圖4J）；吸器被寄主原生質(zhì)膜包裹將吸器與寄主細(xì)胞質(zhì)隔開，使吸器與寄主質(zhì)膜間構(gòu)成了一個(gè)較大的交界面，吸器細(xì)胞壁外被一層較厚的膜包圍（圖4J，K），吸器內(nèi)充滿顏色較深的物質(zhì)，且顏色明顯重于菌絲細(xì)胞，但是沒有觀察到液泡。從試驗(yàn)結(jié)果可充分看出吸器和菌絲細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)明顯不同，吸器與質(zhì)膜間的交界面很可能是病菌與寄主間識別、營養(yǎng)物質(zhì)交換的場所，而吸器外膜很可能是吸器為了抵御寄主分泌物的破壞。隨著病原菌通過進(jìn)一步侵入和擴(kuò)展，柵欄細(xì)胞內(nèi)部葉綠體細(xì)胞器腫脹，聚集，呈球形，有的葉綠體已被破壞，基粒片層不明顯，隨著葉綠體變形程度的增加，細(xì)胞內(nèi)的嗜鋨顆粒增多（圖4L）；沒有聚集的葉綠體腫脹，與細(xì)胞質(zhì)膜分離，分離區(qū)域充滿顆粒狀物，淀粉粒由長條形變?yōu)闄E圓形或三角形，嗜鋨顆粒增多、基粒片層等結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化（圖4M）；正常的葉綠體細(xì)胞呈梭形，緊貼于細(xì)胞質(zhì)膜，內(nèi)部可見淀粉粒，嗜鋨顆粒、基粒片層清晰，葉綠體膜完整（圖4N）；正常的白三葉草表皮細(xì)胞細(xì)胞壁較厚，氣孔通道和保衛(wèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整（圖4O）。

圖4 病原菌侵入寄主細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征Fig.4 Ultrastructural characteristics of pathogen invading host cells

2.4 白粉菌形態(tài)學(xué)觀察

形態(tài)特征觀察結(jié)果表明：白三葉草白粉病菌分生孢子呈橢圓形或卵圓形，大小為（12.41～24.52）μm×（25.95～45.02）μm，平均大小為17.36 μm（標(biāo)準(zhǔn)差standard deviation，SD=2.20）×34.16 μm（SD=3.93）（圖5A）。葉片上觀察到的分生孢子梗直立，每個(gè)孢子梗串生2～3 個(gè)分生孢子，分生孢子梗長度為（6.64～12.46）μm×（21.94～59.48）μm，平均長度為9.95 μm（SD=1.58）× 46.19 μm（SD=9.00）（圖5B）。在水瓊脂玻片上觀察到分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管較長，芽管頂端略膨大，中部下方凸起形成侵入結(jié)構(gòu)（圖5C），在葉片上觀察到分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管，芽管頂端膨大形成橢圓形的附著胞，附著胞大小為（3.27～7.82）μm×（6.51～13.66）μm（圖5D）。形態(tài)特征與《真菌鑒定手冊》［23］和《中國真菌志第一卷·白粉菌目》［24］中豌豆白粉菌描述基本一致，隸屬子囊菌亞門真菌（Ascomycotina）。

圖5 白三葉白粉病病原菌的形態(tài)特征Fig.5 Morphological characteristics of fungus causing powdery mildews on T.repens

2.5 白粉菌的分子鑒定

經(jīng)過PCR 擴(kuò)增，分別獲得了2 個(gè)菌株BF1和BF2的ITS 序列長度分別為681 和696 bp（圖6），將BF1、BF2與Genbank 中已知序列進(jìn)行Blast 比對分析，發(fā)現(xiàn)BF1、BF2與豌豆白粉菌同源性均達(dá)到99%。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示BF1和BF2與豌豆白粉菌（登錄號為KY661145.1 和KY661137.1）在同一分枝（圖7）。本研究認(rèn)為，BF 菌株為豌豆白粉菌。

圖7 ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree constructed by ITS sequence

2.6 白粉菌分生孢子生物學(xué)特性觀察

由表1可知，分生孢子對溫度適應(yīng)范圍較寬，在5～30 ℃均可萌發(fā)，4 h開始萌發(fā)，24 h 時(shí)，15、20 和25 ℃萌發(fā)率分別達(dá)到40.47%、35.85%、47.53%。表明25 ℃最適白粉菌分生孢子萌發(fā)。而5 ℃條件下，4 h基本不萌發(fā)，24 h 時(shí)萌發(fā)率僅為7.55%。各時(shí)間段萌發(fā)增長率不一，25 ℃萌發(fā)增長率在4～6 h 最高。

表1 不同溫度對白三葉草白粉菌分生孢子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of different temperatures on the conidia germination of powdery mildew in T.repens

不同光照條件的試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），4 h 時(shí)全光照處理萌發(fā)率最大為20.06%，其次是光暗交替，最小是全黑暗為8.33%，全光照與全黑暗在4 h 時(shí)有顯著性差異，6、8、12 和24 h 萌發(fā)率無顯著差異，但全光照萌發(fā)率整體高于全黑暗，表明光照條件有利于白粉病菌分生孢子的萌發(fā)。

表2 不同光照對白三葉草白粉菌分生孢子萌發(fā)的影響Table 2 Effect of different lights on the conidia germination of powdery mildew in T.repens（%）

不同pH 對分生孢子萌發(fā)的試驗(yàn)結(jié)果表明（表3），pH 4.0～9.0 時(shí)分生孢子均可萌發(fā)，在萌發(fā)24 h 時(shí)pH 6.0～8.0 之間萌發(fā)率無顯著性差異，pH 7.0 為最適，萌發(fā)率達(dá)到45.50%，pH 4.0 萌發(fā)率最低，僅為15.78%，4 h 時(shí)pH 6.0 和pH 7.0 萌發(fā)率具有極顯著差異，說明在中性或略偏酸性條件更適宜分生孢子萌發(fā)。

表3 不同pH 對白三葉草白粉菌分生孢子萌發(fā)的影響Table 3 Effects of different pH on the conidia germination of powdery mildew in T.repens（%）

3 討論

利用光學(xué)顯微鏡及透射電鏡觀察白粉菌在寄主表皮細(xì)胞的發(fā)育情況及侵染方式是研究白粉菌與白三葉草互作機(jī)理的重要內(nèi)容。Bushnell［25］觀察白粉菌侵入小麥表皮組織發(fā)現(xiàn)，接種白粉菌13 h 后，在表皮組織內(nèi)觀察到了吸器結(jié)構(gòu)的形成。本試驗(yàn)觀察白粉病菌侵染白三葉草葉片12 h 時(shí)附著胞一側(cè)形成侵染釘，形成吸器侵入寄主組織。研究結(jié)果與麥類白粉菌（Erysiphe graminis）［25］以及橡膠樹白粉病菌（Oidium heveae）［26］侵染寄主的研究結(jié)果基本一致。通過菌絲生長過程發(fā)現(xiàn)，分生孢子前期自身提供營養(yǎng)促使菌絲生長，待菌絲順利侵入寄主，分化出大量次生菌絲，此時(shí)分生孢子已不能滿足菌絲生長條件，而是通過吸器吸收寄主營養(yǎng)進(jìn)行生長，此時(shí)表明白粉菌與寄主成功建立了寄生關(guān)系。張?jiān)伱返龋?7］研究發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿受白粉菌侵染后，葉片的柵欄組織結(jié)構(gòu)變形，可進(jìn)行光合作用的葉肉細(xì)胞增多。本試驗(yàn)無論是柵欄組織細(xì)胞還是海綿組織中均未觀察到有菌絲侵染，雖然柵欄組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚完整，但是細(xì)胞排列疏松，尤其是柵欄組織細(xì)胞內(nèi)的葉綠體腫脹變形聚集，分析認(rèn)為可能是病原菌分泌了降解酶破壞了葉綠體膜和類囊體膜，導(dǎo)致葉綠體瓦解。葉綠體結(jié)構(gòu)的完整性是保障植物進(jìn)行光合作用的基礎(chǔ)［28］，淀粉粒和嗜鋨顆粒數(shù)量的變化是維持葉綠體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的一種動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制。研究表明，葉綠體結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)，光合作用合成的糖類輸出受阻或產(chǎn)量降低而迅速轉(zhuǎn)化為淀粉，導(dǎo)致淀粉在葉綠體中大量累積形成淀粉粒［29］，而嗜鋨顆粒是類囊體膜的動(dòng)態(tài)脂質(zhì)庫，當(dāng)類囊體膜中脂質(zhì)過高嗜鋨顆粒就會(huì)吸收變多［30］。Van Wijk 等［31］認(rèn)為類囊體膜解體與嗜鋨顆粒超量化有著很強(qiáng)的相關(guān)性，當(dāng)植物暴露于干旱或高光時(shí)嗜鋨顆粒迅速增加，脅迫解除后嗜鋨顆粒減小。劉敏等［32］在研究葡萄（Vitis vinifera）葉片受高溫脅迫后葉綠體超微結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn)，葉綠體膨脹，葉綠體膜解體，淀粉粒和嗜鋨顆粒增多變大。徐威等［33］在研究NaCl 脅迫對白三葉草葉片超微結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn)，在低鹽脅迫下，葉綠體開始變形，基粒片層松散變形，淀粉粒與嗜鋨顆粒增多。本試驗(yàn)觀察到白粉病菌侵入白三葉寄主細(xì)胞，破壞葉綠體細(xì)胞，導(dǎo)致淀粉粒變形數(shù)量增多，而嗜鋨顆粒數(shù)量隨著葉綠體細(xì)胞變形程度的增加而增加，與前人研究結(jié)果一致，亦充分表明，淀粉粒和嗜鋨顆粒是葉綠體應(yīng)對生物或非生物脅迫的一種響應(yīng)機(jī)制。史娟等［34］認(rèn)為苜蓿假盤菌定殖在苜蓿葉片內(nèi)的病菌菌絲，首先破壞的細(xì)胞器是葉綠體。苜蓿褐斑病引起牧草質(zhì)量下降和光合速率降低，從細(xì)胞學(xué)角度揭示了感病苜蓿品質(zhì)下降的生理學(xué)機(jī)制。感病白三葉草的品質(zhì)是否會(huì)受到影響需要進(jìn)一步研究闡明。本試驗(yàn)同樣觀察到已侵入與未侵入寄主的菌絲結(jié)構(gòu)存在一定差異，未侵入寄主的菌絲頂端存在線粒體結(jié)構(gòu)，而已侵入寄主的菌絲頂端存在一近圓形的電子致密物，二者頂端結(jié)構(gòu)的差異，亦可能造成二者的生長機(jī)制與侵染方式存在差異。

豌豆白粉菌隸屬于白粉菌目真菌，主要寄生于黃芪（Astragalus membranaceus）、苜蓿、草木樨（Melilotus officinalis）、豌豆（Pisum sativum）、蠶豆（Vicia faba）等豆科植物上［24］。國內(nèi)外對白三葉草白粉病的相關(guān)研究較少，而陳曙暉等［35］依據(jù)紅三葉草白粉病菌絲寄生于寄主表面，分生孢子無色呈橢圓形串生于孢子梗頂端，大小為（13～16）μm×（24～33）μm 等形態(tài)學(xué)特征，將貴州人工草場紅三葉草白粉病病原菌鑒定為半知菌亞門粉孢霉屬白粉粉孢霉菌（Oidium erysiphoides），有性階段為蓼白粉菌。燕勇等［36］認(rèn)為將ITS 序列分析結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相結(jié)合能更準(zhǔn)確地鑒定真菌。由于尚未發(fā)現(xiàn)白三葉草白粉病菌的有性態(tài)，因此，利用無性態(tài)結(jié)構(gòu)特征，結(jié)合分子生物學(xué)鑒定亦是確定病原菌有效的辦法。本試驗(yàn)通過觀察白三葉草白粉菌分生孢子、分生孢子梗、芽管及附著胞的形態(tài)和大小等形態(tài)學(xué)特征，并與《真菌鑒定手冊》［23］和《中國真菌志第一卷·白粉菌目》［24］進(jìn)行對照。同時(shí)對白粉菌菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，認(rèn)為寧夏地區(qū)白三葉草白粉病由子囊菌亞門豌豆白粉菌侵染所致。

生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明白粉菌在5～30 ℃均可萌發(fā)，25 ℃為最佳，全光照條件及中性或略偏酸性條件更適宜分生孢子萌發(fā)。寧夏坐落于西北內(nèi)陸、氣候干旱、日照時(shí)間長［37］，降水量少且集中于6-9月，該氣候特點(diǎn)與病原菌的生物學(xué)特性相吻合，可為田間確定防治時(shí)間提供依據(jù)。

4 結(jié)論

白粉菌侵染白三葉草葉片12 h 時(shí)附著胞一側(cè)形成侵染釘，侵入寄主組織形成吸器，被白粉病菌侵染的白三葉草葉片，表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁被降解、氣孔通道變形，葉綠體腫脹，淀粉粒和嗜鋨顆粒增多，顯示出白粉病菌侵染白三葉草破壞葉綠體的一種侵染機(jī)制，而白粉病菌實(shí)施了何種侵染策略有待于深入研究。依據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合ITS 序列分析將寧夏地區(qū)白三葉草白粉病的致病菌鑒定為豌豆白粉菌。