侯亞威 李亞蒙 徐玉坤 肖振衛(wèi)

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東濟南 250000；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，山東濟南 250000；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腎病科，山東濟南 250000

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabeticperipheralneuropathy，DPN）是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，主要以手腳或腿疼痛、感覺異常為特征，并伴有周圍神經(jīng)病變[1]。炎癥介質(zhì)、代謝異常及神經(jīng)元活性與DPN 的發(fā)病機制密切相關(guān)，DPN 的治療可能涉及到多種聯(lián)合治療，其中包括控制血糖水平和疼痛，研究者們一直尋求治療DPN 最有效的手段[2]。

DPN 在中醫(yī)屬消渴病中“痹癥”范疇，認(rèn)為此病病機多為“氣虛血瘀”，同時，多年臨床實踐發(fā)現(xiàn)雞血藤-寄生在改善DPN 患者的疼痛狀態(tài)及感覺異常方面效果顯著，查閱資料發(fā)現(xiàn)，桑寄生-雞血藤亦是祝諶予老師之經(jīng)驗伍用，其與降糖藥參合，屢見奇效[3]。雞血藤，味苦微甘，性溫，歸肝經(jīng)，能夠補血活血、舒筋絡(luò)；桑寄生，味苦甘，性平，可補肝腎，強筋骨；二者伍用，補肝腎、強筋骨、通絡(luò)之力加強[4-5]。

中藥方劑治療疾病在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中具有多成分、多靶點、多通路的特點，現(xiàn)運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探索雞血藤-桑寄生治療DPN 的分子機制，并通過分子對接進行驗證。

1 材料與方法

1.1 藥物相關(guān)靶點的篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）尋找2 味中藥化學(xué)組成成分，并進行ADME 篩選，按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18 兩個閾值初步獲得藥物的有效活性成分及靶點，并通過TCMID 及中國知網(wǎng)、萬方搜集2017 年2 月至2020 年12 月的文獻補充未預(yù)測到的靶點，刪除未預(yù)測到的靶點成分，并在Uniprot 數(shù)據(jù)庫規(guī)范化合物作用的靶點[6-8]。

1.2 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將藥物活性成分及靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 中，構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，并獲取藥物主要成分。

1.3 疾病相關(guān)靶點的篩選

在GeneCards 中挖掘DPN 的潛在靶點，根據(jù)學(xué)者經(jīng)驗，設(shè)Score 值≥2 倍中位數(shù)的靶點為DPN 的潛在靶點[9]，并在TTD、DRUGBANK 中尋找DPN 靶點，刪除重復(fù)靶點。

1.4 藥物疾病交集靶點獲取及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為明確藥物-疾病靶點間的相互作用，利用R 語言繪制維恩圖，獲取交集靶點，通過STRING 數(shù)據(jù)庫進行PPI 分析，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)，借助Cytoscape 3.7.2，對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行拓?fù)浞治黾翱梢暬?，并獲取核心靶點[10]。

1.5 GO 與KEGG 分析及其可視化

將核心靶點導(dǎo)入Metascape 平臺，完成GO 及KEGG 分析，通過生物信息平臺對結(jié)果進行可視化分析[11]。

1.6 “藥物-成分-通路-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

通過Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建“藥物-成分-通路-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)度值獲取雞血藤-桑寄生治療DPN發(fā)揮作用的核心成分及通路。

1.7 分子對接驗證

為進一步驗證“1.6”中核心成分及其靶點在能量和結(jié)構(gòu)上匹配程度，依據(jù)TCMSP 獲取化合物小分子2D 結(jié)構(gòu)，采用ChemDraw、Chem3D 獲得化合物小分子的3D 結(jié)構(gòu)，運用Pymol，對其進行去水、移除靶蛋白中的配體。從RCSBPDB 中獲取靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)。采用AutoDockTools，設(shè)置其活性口袋，運行Autodockvina 進行分子對接，并采用PyMol 進行結(jié)構(gòu)匹配及可視化分析[12]。

2 結(jié)果

2.1 藥物靶點的獲取

初步獲得化學(xué)成分：雞血藤68 種、桑寄生46 種，經(jīng)ADME 篩選后共獲得活性成分：雞血藤23 種、桑寄生2 種，見表1。雞血藤靶點426 個、桑寄生靶點157 個，刪除重復(fù)靶點共得到178 個靶點。

表1 藥物主要成分

2.2 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，共得到203 個節(jié)點，456 條邊，橢圓形代表靶點，菱形代表活性成分，三角形代表藥物。見圖1。

圖1 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 疾病靶點的獲取

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲得疾病靶點4778 個。該靶點Score 中位數(shù)為5.54，故設(shè)定Score 值≥11.8 的靶點為DPN 的潛在靶點。結(jié)合TTD、OMIM、DRUGBANK補充靶點，刪除重復(fù)值，得到1199 個靶點。

2.4 維恩圖及PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

藥物靶點及DPN 靶點篩選后取交集，繪制緯恩圖，得到78 個交集靶點，見圖2。PPI 網(wǎng)絡(luò)共有1413 條邊，見圖3。對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行拓?fù)浞治?，得?4 個核心靶點，見圖4。

圖2 “藥物-疾病”維恩圖

圖3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

圖4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用拓?fù)浞治?/p>

2.5 GO 與KEGG 分析

通過Metascape 平臺對“2.4”中核心靶點進行通路信號分析，以富集分析的中位數(shù)為依據(jù)，GO 中生物過程（biological process，BP）選取25 個、GO 的細(xì)胞成分（cell componcnt，CC）選取10 個、GO 的分子功能（molecular furction，MF）選取9 個進行富集三合分析，見圖5。KEGG 選取22 條通路進行可視化，見圖6（封四）。

圖5 核心靶點GO 分析

圖6 KEGG信號通路氣泡圖

2.6 “藥物-成分-通路-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

借助Cytoscape 3.7.2 繪制“藥物-成分-通路-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，對“2.5”中KEGG通路進一步分析，該網(wǎng)絡(luò)有66 個節(jié)點，118 條邊，方形代表靶點，菱形代表成分，橢圓形代表通路，三角形代表藥物，并根據(jù)度值發(fā)現(xiàn)TP53、EGFR、ESR1（度值分別為12、10、4）為主要核心靶點及其成分、通路。見圖7。

圖7 “藥物-成分-通路-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對接結(jié)果

“2.6”中主要核心靶點與其成分對接結(jié)果所示，槲皮素、木犀草素、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮與相應(yīng)靶點都具有較好的親和力，具體見表2，對接模式見圖8。

圖8 分子對接模式圖

表2 分子對接結(jié)合能

3 討論

雞血藤作為常用的活血通絡(luò)藥，亦為“血分圣藥”，具有抗炎、抗氧化等功效；桑寄生具有神經(jīng)保護、降血糖等作用；DPN 的發(fā)生發(fā)展是氧化應(yīng)激、糖脂類代謝異常、JAK-STAT 信號通路維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定失調(diào)及雪旺細(xì)胞的病變等綜合作用的結(jié)果[13-17]。

雞血藤、桑寄生主要活性成分為槲皮素、木犀草素、芒柄花黃素；王保江等[18]進行大鼠實驗發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠改善四氧嘧啶所致的DPN；施建豐等[19]發(fā)現(xiàn)木犀草素可能通過改變巨噬細(xì)胞的極性從而調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的表達；木犀草素能夠在各種神經(jīng)退行性變中降低氧化應(yīng)激[20]。

PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鲫U釋蛋白互作關(guān)系，并篩選出64 個核心靶點，結(jié)合GO 分析，其中EGFR 屬于酪氨酸激酶受體，EGFR 二聚自磷酸化后主要引導(dǎo)下游MAPK、JAK-STAT 及PI3K-Akt通路磷酸化，調(diào)控脂多糖引起的炎癥、細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激反應(yīng)；PARP1 上調(diào)則細(xì)胞存活，抑制PARP1 則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；ESR1調(diào)控內(nèi)分泌系統(tǒng)、甲狀腺激素的分泌；TP53通過磷酸化調(diào)節(jié)其活性，通過調(diào)控下游MAPK、PI3K-Akt、Wnt 等通路參與調(diào)控細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)上游代謝基因表達、促進DNA 修復(fù)基因轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)過程[21-23]。

KEGG中選取MAPK、JAK-STAT、PI3K-Akt 等22 條信號通路分析，發(fā)現(xiàn)木犀草素與槲皮素通過MAPK信號通路調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng);木犀草素、槲皮素干預(yù)的PI3K-Akt 信號通路參與葡萄糖的轉(zhuǎn)運、增殖、凋亡和分化等多種細(xì)胞功能；芒柄花黃素、毛蕊異黃酮通過內(nèi)分泌抵抗、甲狀腺激素信號通路調(diào)控糖脂代謝，促進新血管生成的生物過程[24-26]。分析對接驗證中發(fā)現(xiàn)，活性成分與對應(yīng)靶點均<-5 kcal/mol，研究者認(rèn)為結(jié)合能<-5 kcal/mol 是分子對接時受體與配體穩(wěn)定結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)，且結(jié)合能越低分子對接結(jié)合穩(wěn)定性越高[27]；故活性成分與對應(yīng)的靶點有較好的對接活性。

本研究探討雞血藤-桑寄生治療DPN 的分子機制，發(fā)現(xiàn)雞血藤-桑寄生主要通過EGFR、ESR1、PARP1等64 個與DPN 相關(guān)的潛在靶點，改善糖脂類代謝、保護神經(jīng)元、調(diào)控細(xì)胞凋亡，且分子對接驗證了這一結(jié)果的可靠性，為臨床治療及研發(fā)新的藥物提供思路。