魏姣姣 黃喜海

摘 要：由于食品表面非目標(biāo)源的干擾，食品微生物污染檢測的結(jié)果存在一定偏差，為此，本文提出一種基于ATP生物熒光增幅法的食品微生物污染檢測方法，利用微生物的繁殖特性，將營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過統(tǒng)計(jì)顯微環(huán)境下熒光ATP的增幅，判定檢測食品中是否存在微生物，避免直接統(tǒng)計(jì)受到的干擾，以此實(shí)現(xiàn)對食品微生物污染的有效檢測。

關(guān)鍵詞：微生物污染;微生物檢測;ATP生物熒光增幅法;熒光標(biāo)記

食品安全問題的來源是多方面的，不僅包括原料質(zhì)量、加工技術(shù)、生產(chǎn)環(huán)境，更主要的是對其的保管與儲(chǔ)存[1]。對于部分特殊的食品，微生物污染是主要影響產(chǎn)品質(zhì)量的因素，而出現(xiàn)微生物污染的環(huán)節(jié)也是多樣性的，從原材料的產(chǎn)出到產(chǎn)品銷售，中間的任意環(huán)節(jié)都有可能出現(xiàn)微生物污染[2]。在食品被污染的前期，并不會(huì)在外觀上表現(xiàn)出明顯的變化，但食品本身很可能已經(jīng)變質(zhì)，如果不能及時(shí)檢出，在市面上被銷售，極有可能產(chǎn)生嚴(yán)重的食品安全問題[3]。傳統(tǒng)的微生物檢測主要是對檢測物品進(jìn)行微生物培養(yǎng)，不僅對檢測操作的要求較高，檢測周期也相對較長，這與現(xiàn)階段快節(jié)奏的生活方式并不契合，且其檢測結(jié)果也具有一定的失準(zhǔn)性，效果并不理想[4]。ATP生物熒光增幅法作為近些年來逐漸被關(guān)注的微生物檢測方法，不但具有較高的檢測效率，同時(shí)操作更加便捷，在檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

基于此，本文提出基于ATP生物熒光增幅法的食品微生物污染檢測方法。使用ATP熒光對營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，通過統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)過后ATP熒光的增幅判斷食品中是否存在微生物污染，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該方法的有效性，以期為食品的微生物污染檢測提供有價(jià)值的參考。

1 食品微生物污染檢測

1.1 熒光染色標(biāo)記

在傳統(tǒng)的食品微生物檢測中，主要是通過對樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的方式判定其是否被污染，通過培養(yǎng)結(jié)果分析微生物存在的可能性，結(jié)果的可靠性相對較低[5]。本文將ATP生物熒光增幅法應(yīng)用于微生物污染檢測中。

對營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行熒光標(biāo)記，一般情況下，當(dāng)食品中出現(xiàn)微生物污染時(shí)，隨著微生物的衍生，其需要不斷吸取食品中的營養(yǎng)物質(zhì)作為其生存的基礎(chǔ)，此時(shí)的食品可以理解為是微生物的營養(yǎng)基，本文利用這一特點(diǎn)，在使用中加入包含熒光劑成分的高濃度營養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)食品中有微生物時(shí)，可以通過顯微觀察發(fā)現(xiàn)移動(dòng)的熒光，由于營養(yǎng)液自身也是非靜態(tài)的，直接統(tǒng)計(jì)的結(jié)果存在一定偏差，利用動(dòng)態(tài)熒光的增加程度，可以實(shí)現(xiàn)對微生物數(shù)量的準(zhǔn)確判斷。需要注意的是，在對營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行熒光染色時(shí)，要避免熒光在食品表面的印染，當(dāng)其對食品本身產(chǎn)生染色作用時(shí)，會(huì)影響最終的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，因此，本文選用ATP作為染色材料。

1.2 ATP熒光增幅分析

ATP生物熒光增幅檢測法本質(zhì)上是利用了微生物的生存需求和繁衍的基本原理，在完成對營養(yǎng)物質(zhì)的標(biāo)記后，在（37.5±0.5）℃的溫度環(huán)境中，培養(yǎng)2 h，再使用沖洗液對其表面進(jìn)行沖洗，此時(shí)需要注意沖洗的力度不應(yīng)過大，否則會(huì)造成含有ATP熒光的微生物被全部沖走，無法進(jìn)行后續(xù)的檢測工作。沖洗完成的待檢食品需要在相對濕度為（60±5）%的環(huán)境中靜置10 min直至其表面處于干燥狀態(tài)。此時(shí)通過顯微鏡觀察食品表面是否存在ATP熒光成分，如果不存在，則表明食品不存在微生物污染，如果存在，記錄觀察到的微生物數(shù)量。完成后再重新將其置于（37.5±0.5）℃的溫度環(huán)境培養(yǎng)2 h。完成后重復(fù)上面的操作，沖洗、晾干，再次在顯微環(huán)境下觀察ATP熒光的數(shù)量，統(tǒng)計(jì)其實(shí)際增量。如果ATP熒光的數(shù)量未出現(xiàn)變化，同樣表明檢測食品沒有出現(xiàn)微生物污染的情況，如果出現(xiàn)明顯的增幅，則表明存在微生物。結(jié)合其增幅與時(shí)間的關(guān)系，推斷微生物的總量。本文將ATP熒光增幅作為最終檢測結(jié)果的判定依據(jù)，避免了鹽、其他化學(xué)物質(zhì)和游離態(tài)在食品中的干擾，使檢測結(jié)果具有更高的準(zhǔn)確性。

2 應(yīng)用測試

對本文提出的微生物檢測方法進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用測試。并將文獻(xiàn)[2]和文獻(xiàn)[3]提出的檢測方法作為對照組，通過對比3種方法的檢測結(jié)果，分析本文方法的效果。

2.1 樣本設(shè)置

本文將復(fù)蘇的HFSCs細(xì)胞在DM EM/F12培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，共分為3組，另外取3個(gè)DM EM/F12培養(yǎng)基，進(jìn)行枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)，白假絲酵母菌的培養(yǎng)，同樣將其置于分別接種到DM EM/F12培養(yǎng)基中，并將其置于溫度為（37.5±0.5）℃，相對濕度為（60±5）%的環(huán)境中，時(shí)間為2 h。最后取3個(gè)DM EM /F12培養(yǎng)基，直接置于溫度為（37.5±0.5）℃，相對濕度為（60±5）%的環(huán)境中培養(yǎng)2 h，將其作為陰性對照組。

2.2 實(shí)驗(yàn)過程

選擇典型支原體污染試驗(yàn)樣本作為陽性對照。含

HFSCs玻片在不含抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后，吸取培養(yǎng)液，用PBS沖洗，用冷空氣干燥，用固定液固定5 min。將制備的ATP Hoechst3342工作染料添加到固定細(xì)胞中，并在室溫下染色30 min，染色的蓋玻片用PBS浸泡3次，每次3 min，用冷空氣干燥，含1%甘油的PBS覆蓋在細(xì)胞表面。密封處理后，干燥，觀察細(xì)胞核周圍是否產(chǎn)生ATP熒光。

2.3 檢測結(jié)果

在上述基礎(chǔ)上，對比3種方法對不同培養(yǎng)基的檢測結(jié)果，具體如表1所示。廖燮恒等[2]和白淼等[3]的方法均未實(shí)現(xiàn)對HFSCs的有效檢出，同時(shí)，廖燮恒等[2]方法對白假絲酵母菌的檢出不明顯，白淼等[3]的方法對枯草芽孢桿菌的檢出方法不明顯。相比之下，本文方法實(shí)現(xiàn)了對4組樣品的準(zhǔn)確檢出，檢測結(jié)果更加可靠。

3 結(jié)論

隨著食品加工行業(yè)的蓬勃發(fā)展，對食品質(zhì)量控制的重要性也越來越受到重視，其中微生物污染檢測作為一項(xiàng)難度較高，流程較為復(fù)雜的檢測環(huán)節(jié)，一直是產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要方式。而微生物污染前期，食物外觀上的表現(xiàn)并不明顯，對其檢測也更加困難。本文提出的基于ATP生物熒光增幅法的食品微生物污染檢測方法，并實(shí)現(xiàn)了對微生物的準(zhǔn)確檢出。通過本文的研究，以期為食品安全檢測工作提供有價(jià)值的幫助。

參考文獻(xiàn)

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