崔勝宇，徐 林，浦 湧，夏 豪

（1. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，武漢大學(xué)心血管病研究所，心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430060；2. 武漢市漢南區(qū)人民醫(yī)院，武漢大學(xué)人民醫(yī)院漢南醫(yī)院，湖北武漢 430060）

心肌梗死（MI）是最嚴(yán)重的心血管疾病之一，發(fā)病率和死亡率很高［1］，主要是由于多種原因包括冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓形成導(dǎo)致的冠脈長(zhǎng)時(shí)間閉塞，引起心肌細(xì)胞缺血缺氧后壞死。血小板在冠脈內(nèi)血栓形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，血小板的聚集和功能活化是導(dǎo)致MI 的重要原因之一，因此臨床針對(duì)心血管疾病的治療最常見(jiàn)的手段之一就是抗血小板治療。相關(guān)研究表明，檢測(cè)分析血小板RNA 的表達(dá)可以為血小板的正常止血和血栓形成功能，以及血小板如何參與心梗發(fā)作，反應(yīng)和預(yù)后提供新的見(jiàn)解［2］。本文通過(guò)檢索挖掘GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物信息學(xué)的相關(guān)方法，篩選心梗患者與正常人血小板miRNA及mRNA 差異表達(dá)基因，構(gòu)建miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行生物學(xué)功能及信號(hào)通路富集分析，揭示血小板的表達(dá)與功能改變。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

在GEO 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）分別檢索心梗病人的miRNA 及mRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)。 miRNA 芯片數(shù)據(jù)來(lái)源于GSE24548，mRNA 芯片數(shù)據(jù)來(lái)源于GSE24519。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選

使用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)下的GEO2R 進(jìn)行表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析，GEO2R 是基于R 語(yǔ)言的在線分析工具，使用到Biobase、GEOquery 及l(fā)imma 包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以|logFC|＞1、P＜0.05 為篩選條件進(jìn)行差異miRNA 及mRNA 的篩選。使用R 語(yǔ)言中的ggplot2 包進(jìn)行差異miRNA 的火山圖繪制。

1.3 靶基因的預(yù)測(cè)及提取交集

使用FunRich 3.1.3 軟件中的尋找miRNA 靶基因功能進(jìn)行miRNA 的靶基因預(yù)測(cè)，而后運(yùn)用Perl語(yǔ)言腳本，對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因與差異mRNA 取交集并與miRNA 交叉匹配，即高表達(dá)的miRNA 與低表達(dá)的mRNA 匹配，低表達(dá)的miRNA 與高表達(dá)的mRNA 匹配，最終得到miRNA-mRNA 對(duì)應(yīng)調(diào)控關(guān)系文件。

1.4 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用miRNA-mRNA 對(duì)應(yīng)調(diào)控關(guān)系文件在JAVA 環(huán)境下使用Cytoscape 3.8.0 進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可視化，構(gòu)建miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.5 信號(hào)通路及生物學(xué)功能分析

利用和R 語(yǔ)言的clusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2 包對(duì)交集中的基因進(jìn)行KEGG 富集可視化分析及GO 可視化分析，設(shè)定參數(shù)“Pvalue cutoff ＝0.05，Q value cutoff ＝0.05”。利用Perl 語(yǔ)言腳本和R 語(yǔ)言的digest、GOplot 包對(duì)KEGG 富集結(jié)果進(jìn)行圈圖繪制。

2 結(jié)果

2.1 差異miRNA 及mRNA 的篩選

miRNA 芯片數(shù)據(jù)（GSE24548）共篩選到差異miRNA 27 種，mRNA 芯片數(shù)據(jù)（GSE24519）共篩選到差異mRNA 2 897 個(gè)，圖1 示差異表達(dá)的火山圖。

圖1 miRNA 及mRNA 差異表達(dá)火山圖Fig 1 Volcano map of differentially expressed miRNA and mRNA

2.2 預(yù)測(cè)靶基因與差異mRNA 取交集后交叉匹配并可視化

27 種差異miRNA 共預(yù)測(cè)到靶基因3 563 個(gè)，與差異mRNA 取交集后得到376 個(gè)共同基因，這些共同基因與miRNA 交叉匹配后，共得到503 個(gè)miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系，在大部分調(diào)控關(guān)系中，miRNA 呈現(xiàn)表達(dá)下調(diào)（綠色），與之對(duì)應(yīng)的mRNA呈現(xiàn)上調(diào)（紅色）。使用Cytoscape 3.8.0 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化作圖，見(jiàn)圖2。

圖2 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig 2 miRNA-mRNA regulation network

2.3 miRNA 調(diào)控基因的KEGG 富集分析

對(duì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）中的靶基因進(jìn)行KEGG 富集分析（圖3），結(jié)合富集基因數(shù)及調(diào)整后P值，排名前五的信號(hào)通路包括：PI3K-AKT 信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、MAPK 信號(hào)通路、人乳頭瘤病毒感染、Ras 信號(hào)通路，而低表達(dá)的基因中富集結(jié)果主要涉及GAB2、ITGB8、PAK1、LPAR2 基因，主要富集PI3K-AKT 信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)兩個(gè)通路（圖4）。

圖3 靶基因KEGG 富集分析Fig 3 KEGG enrichment analysis of target genes

圖4 KEGG 富集分析圈圖Fig 4 Circle graph of KEGG enrichment analysis

2.4 miRNA 調(diào) 控 基 因 的GO 分 析

對(duì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）中的靶基因進(jìn)行GO 分析（圖5），展示了生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組成（CC）、分子功能（MF）的前10 個(gè)最顯著的GO Term。 BP中靶基因主要涉及軸突發(fā)生、軸突樹突狀蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、基于微管的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞骨架依賴性細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、呼吸管發(fā)育、沿微管運(yùn)輸、發(fā)育參與形態(tài)發(fā)生、高爾基小泡運(yùn)輸、在子宮內(nèi)胚胎發(fā)育中、突觸組織。CC中靶基因主要涉及神經(jīng)脊柱、樹突棘、突觸后膜、突觸后專業(yè)化、突觸后密度、不對(duì)稱突觸、神經(jīng)元到神經(jīng)元突觸、突觸膜、突觸前、網(wǎng)格蛋白包被的囊泡膜。MF 主要涉及蛋白質(zhì)大分子銜接子活性、分子銜接子活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄阻遏物活性等。

圖5 靶基因GO 分析Fig 5 GO analysis of target genes

3 討論

心肌梗死的發(fā)生與粥樣斑塊破裂繼發(fā)的血栓形成關(guān)系密切，血小板在血栓形成中又起主導(dǎo)作用，因此，探尋心梗病人血小板中基因的差異表達(dá)就顯得很有意義。本研究比較了急性心梗病人血小板中差異表達(dá)的miRNA，由于miRNA 主要發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)靶基因的作用［3］，因此我們通過(guò)預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行了其靶基因的預(yù)測(cè)，并與芯片數(shù)據(jù)篩選出的差異mRNA 取交集，再通過(guò)Cytoscape 基因互作分析軟件做出了miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，最后通過(guò)R 語(yǔ)言的方法繪制出了靶基因富集的的KEGG與GO 分析，揭示了血小板基因在心梗中的差異表達(dá)及可能作用，為可能的靶向干預(yù)治療提供了一個(gè)方向。

經(jīng)火山圖可以看出，miRNA 芯片數(shù)據(jù)大部分呈現(xiàn)低表達(dá)，mRNA 芯片數(shù)據(jù)大部分呈現(xiàn)高表達(dá)，說(shuō)明兩芯片數(shù)據(jù)較為一致。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的miRNA 與心 血 管 疾 病 密 切 相 關(guān)：Zhou 等［4］的 研 究 發(fā) 現(xiàn)miR-29b-3p 可通過(guò)調(diào)節(jié)TGFβ1/Smad3 通路在缺氧的心肌細(xì)胞中發(fā)揮保護(hù)作用；miR-19a-3p 被報(bào)道在缺血性腦卒中中參與了炎癥反應(yīng)，血液凝固和血小板活化［5］；miR-32-5p 可調(diào)控人心臟成纖維細(xì)胞的凋亡，增殖和表型變化［6］；miR-142-3p 可從活化的血小板經(jīng)血小板衍生微粒傳遞到內(nèi)皮細(xì)胞中促進(jìn)高血壓中內(nèi)皮細(xì)胞的增殖［7］；循環(huán)中miR-133b 的水平也被證實(shí)與接受冠脈介入治療的心?；颊叩呐R床預(yù)后 密 切 相 關(guān)［8］；此 外，Weng 等［9］的 研 究 發(fā) 現(xiàn) 抑 制miR-34a-5p 可能通過(guò)刺激CTRP9 的表達(dá)促進(jìn)脂肪干細(xì)胞對(duì)心梗損傷的保護(hù)功能。

對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖中的靶基因進(jìn)行KEGG 富集分析顯示，靶基因主要參與PI3K-AKT 信號(hào)通路。PI3K-AKT 通路已被報(bào)道廣泛參與各種原因所致的血小板的活化過(guò)程并直接參與整聯(lián)蛋白功能的調(diào)節(jié)［10-12］，在心梗發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。MAPK信號(hào)通路也被報(bào)道廣泛參與血小板的聚集、鈣動(dòng)員、顆粒分泌和纖維蛋白原與整聯(lián)蛋白αIIbβ3 的結(jié)合［13，14］。同樣的，Ras 信號(hào)通路與血小板的活化也密切相關(guān)［15］。血小板的活化在心梗發(fā)生過(guò)程中占據(jù)重要作用，其活化后通過(guò)黏附、聚集、釋放等機(jī)制參與血栓形成。因此，針對(duì)這些富集的通路，我們應(yīng)該可以調(diào)控血小板活化進(jìn)程，對(duì)血栓的形成進(jìn)行靶向干預(yù)。

對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖中的靶基因進(jìn)行的GO 分子功能分析顯示，靶基因主要涉及蛋白質(zhì)大分子銜接子活性、分子銜接子活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄阻遏物活性等功能，這些功能都提示了血小板的活化過(guò)程，揭示了血小板的激活在心梗發(fā)生過(guò)程中的重要作用。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法篩選出了心梗病人血小板中差異表達(dá)的miRNA，構(gòu)建了miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)一步對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的靶基因進(jìn)行通路和功能分析，揭示了血小板中miRNA及相關(guān)基因在心梗發(fā)生中的重要作用，為今后的干預(yù)治療及靶點(diǎn)選擇提供了新的見(jiàn)解。