趙欣華，張東旭，趙恬靜，龐雪瑩，劉松江

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150000；2. 中國人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學中心，北京 100091；3. 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000）

2020 年1 月世界衛(wèi)生組織將新型冠狀病毒病正式命名為Corona Virus Disease 2019（COVID-19）［1］。該病主要通過呼吸道飛沫和密切接觸傳播，傳染度極高。主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳、乏力。重癥患者多在發(fā)病1 周后出現(xiàn)呼吸困難和/或低氧血癥，嚴重者可快速惡化為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒血癥及多器官衰竭等。針對重癥及危重型患者，目前多在對癥治療的基礎(chǔ)上，采取積極防治并發(fā)癥，預防繼發(fā)感染，對多器官進行功能支持等手段［2］。在境外發(fā)病態(tài)勢呈上升趨勢的背景下，我國疫情得到有效控制，中醫(yī)藥發(fā)揮了重要作用［3］。

四逆加人參湯出自《傷寒論》，由人參、附子、干姜、炙甘草組成，具有回陽救逆、益氣固脫的功效，被多個省級方案推薦應用于新冠肺炎重癥期的治療［4］。四逆加人參湯可能具有治療COVID-19 的作用，但具體機制尚不清晰。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學平臺，篩選對藥物及疾病靶點，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖以及生物過程分析及藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，初步分析了四逆加人參湯治療COVID-19 的作用機制，為基礎(chǔ)研究和臨床應用指明了方向。

1 材料與方法

1.1 四逆加人參湯成分篩選及作用靶點的獲取

運用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索四逆加人參湯中包含的藥物人參、附子，、干姜、甘草，設(shè)置口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，獲取有效活性化合物，將此結(jié)果輸入Uniprot 數(shù)據(jù)庫，對靶點名稱進行規(guī)范。

1.2 COVID-19 靶點的預測及Venn 圖構(gòu)建

運用GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫查詢疾病靶點，將關(guān)鍵詞“Novel coronavirus pneumonia”輸入數(shù)據(jù)庫，查詢疾病靶點。將1.1 中藥物靶點與疾病靶點輸入R-3.6.3 軟件進行映射，繪制Venn 圖。

1.3 藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

為了更加清晰地展示藥物、靶點與疾病之間的關(guān)系，運用Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建藥物-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)合靶點度值對該網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析。

1.4 PPI 相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將四逆加人參湯治療COVID-19 的潛在靶點輸入相互作用平臺String（http：//string-db.org/），進行相互作用蛋白查詢，物種設(shè)置為“人”（“Homo sapiens”），最低相互作用評分設(shè)置為“Medium confidence（中等置信度）”0.400，其余參數(shù)保持默認設(shè)置，獲取相互作用關(guān)系。將相互作用關(guān)系的TSV 數(shù)據(jù)格式輸入到Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)，并使用插件network analyzer 對該網(wǎng)絡(luò)進行分析，根據(jù)degree 值分析關(guān)鍵靶蛋白。

1.5 京都基因和基因組百科全書（KEGG）和基因本體（GO）生物過程富集分析

為了研究四逆加人參湯治療COVID-19 的通路信息和生物過程、分子功能、細胞組分信息，運用DAVID（http：//david.nifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫6.8 對交集靶點進行分析。設(shè)置P＜0.05，根據(jù)富集程度選取前20 條目，利用OmicShare 平臺制作氣泡圖，對結(jié)果進行可視化分析。

1.6 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

基于KEGG 信號通路結(jié)果并參考相關(guān)文獻，篩選出與COVID-19 相關(guān)度較高的信號通路，運用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，并對網(wǎng)絡(luò)圖進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 四逆加人參湯成分篩選及作用靶點的獲取結(jié)果

基于TCMSP 共檢索出四逆加人參湯中活性化合物附子65個，干姜148個，甘草280個，人參190個，設(shè)置篩選條件口服利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18 后，得到四逆加人參湯中有效活性化合物附子21 個，干姜5 個，甘草92 個，人參22 個，總有效活性化合物140 個，去除重復化合物及無對應靶點化合物，結(jié)合文獻共篩選得到有效化合物112 個，對應234 個靶點。部分化合物及靶點信息見表1。

表1 四逆加人參湯活性成分及靶點信息表Tab 1 Active ingredients and targets of Sini Decoction plus Ginseng

2.2 COVID-19 靶點的預測Venn 圖構(gòu)建結(jié)果

運用GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫，得到疾病相關(guān)靶點261 個，將2.1 中藥物靶點與疾病靶點輸入R-3.6.3 軟 件 進 行 映 射，繪 制Venn 圖，得 到50 個 藥物-疾病交集靶點。見圖1。

圖1 四逆加人參湯與COVID-19 靶點基因Venn 圖Fig 1 Target gene Venn diagram of Sini Decoction plus Ginseng

2.3 藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建結(jié)果

使用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，如圖2。該網(wǎng)絡(luò)圖中共包含156 節(jié)點（其中藥物節(jié)點4 個，疾病節(jié)點1 個，有效成分節(jié)點101 個，靶點節(jié)點50 個），623 條邊。藍色代表靶點，黃色代表藥物人參及其對應有效成分，粉色代表干姜，紫色代表附子，綠色代表甘草。此網(wǎng)絡(luò)圖中，邊代表相互作用關(guān)系，一個節(jié)點與其他節(jié)點連線越多代表相互作用關(guān)系越多，則該節(jié)點度值越高，證明該節(jié)點在疾病治療過程中越關(guān)鍵。通過對該網(wǎng)絡(luò)可視化分析發(fā)現(xiàn)，度值較高的有效活性成分包括槲皮素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇等，說明這些化合物是發(fā)揮疾病治療作用的關(guān)鍵化合物。

圖2 藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Network diagram of drug-component-target

2.4 PPI 相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

將四逆加人參湯治療COVID-19 潛在作用靶點蛋白導入STRING 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。得到TSV 文件并導入Cytoscape 3.7.2 進行可視化分析，如圖3。圖中有50 個節(jié)點，708 條邊，其中節(jié)點代表交集蛋白，圖形越大，顏色越深則代表度值（degree）越大，邊則表示蛋白間的關(guān)聯(lián)作用。圖中節(jié)點的平均度值為28.32；中心度（closeness centrality）平均值為0.794；介數(shù)（betweenness Centrality）平均值為0.008 9。度值較高靶點分別為白細胞介素-6（IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、絲 裂 原 活 化 蛋 白 激 酶1（MAPK1）、TP53、腫 瘤 壞 死 因 子（TNF）、胱 天 蛋 白 酶3（CASP3），提示這些靶點可能是發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點。見圖4。

圖4 四逆加人參湯治療COVID-19 關(guān)鍵靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)分析Fig 4 Network analysis of key targets of Sini Decoction plus Ginseng for the treatment of COVID-19

2.5 KEGG 和GO 生物過程富集分析結(jié)果

GO 富集功能分析包括生物過程（BP）、細胞組成（CC）、分析功能（MF）。將50 個交集基因輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫進行發(fā)現(xiàn)涉及生物過程341 個，細胞組分33 個，分子功能50 個。設(shè)置P＜0.05，各選取前20 個條目，運用OmicShare 平臺制作氣泡圖。見圖5～7。其中橫坐標表示富集因子，縱坐標表示GO 條目名稱。顏色代表P-value，顏色越紅，該值越小。氣泡大小表示富集的基因個數(shù)，氣泡越大表示富集的基因個數(shù)越多。

圖5 生物過程富集分析Top20Fig 5 Top 20 enrichment of biological process

將50 個交集基因輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫進行KEGG 信號通路富集功能分析，共有112 條信號通路?；贙EGG 信號通路結(jié)果并結(jié)合文獻，篩選后共得出與COVID-19 相關(guān)的信號通路20 條。見圖8。包括TNF 信號通路、結(jié)核、甲型流感、HTLV-1 感染、p53 信 號 通 路、PI3K-Akt 信 號 通 路、HIF-1 信 號通路、MAPK 信號通路、NF-κB 信號通路、NOD 樣受體信號通路、VEGF 信號通路、FoxO 信號通路、Toll 樣受體信號通路等。

圖8 KEGG 通路信息圖Fig 8 Diagram of KEGG signaling pathway

圖6 細胞組成富集分析Top20Fig 6 Top 20 enrichment of cellular component

圖7 分析功能富集分析Top20Fig 7 Top 20 enrichment of analysis function

2.6 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建結(jié)果

為了更加清晰地展現(xiàn)藥物成分、疾病靶點與通路的關(guān)系，構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖。見圖9。該網(wǎng)絡(luò)圖中一共有182 個節(jié)點，包括活性成分節(jié)點112個，靶點節(jié)點50 個，通路節(jié)點20 個，534 條邊。該網(wǎng)絡(luò)圖中，度值較高的通路分別為結(jié)核、甲型流感、TNF 信號通路、MAPK 信號通路、Toll 樣受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路、HIF-1、NF-κB 信號通路。度值較高的靶點分別為PTGS2、NOS2、MAPK14、RELA、MAPK1、NOS3、MAPK3、TNF、IL-6 等。度值較高的活性成分分別為槲皮素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇等。

圖9 成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig 9 Network diagram of component-target-pathway

3 討論

國家及多省市衛(wèi)健委發(fā)布的關(guān)于新冠肺炎診療方案中，肺炎（危）重癥患者內(nèi)閉外脫證臨床表現(xiàn)為神昏、煩躁、胸腹灼熱、手足逆冷、呼吸急促或急需輔助通氣。其他癥狀包括舌質(zhì)紫絳，苔黃褐或燥，脈浮大無根［4］。推薦用藥為參附注射液、血必凈注射液、四逆加人參湯、麻杏甘石湯等。研究表明參附注射液可通過調(diào)節(jié)機體免疫和炎癥反應發(fā)揮對COVID-19 的治療作用［5］。血必凈注射液可通過調(diào)節(jié)人體免疫炎癥反應來保護重要器官，通過作用于病毒必需蛋白3CL 水解酶及其人體受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-2（ACE2）而產(chǎn)生一定的抗病毒作用［6］。麻杏甘石湯可通過炎癥通路、抑制細胞因子風暴，免疫調(diào)節(jié)等多條途徑治療COVID-19［7］。四逆加人參湯具有回陽救逆、益氣固脫的功效，但作為新冠肺炎重癥者推薦用藥其作用機制尚不明確。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學分析，初步闡釋了其可能作用的分子機制。

本研究表明，四逆加人參湯治療COVID-19 發(fā)揮作用的主要成分為槲皮素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇。槲皮素屬于黃酮類化合物，有較為廣泛的藥理作用，包括抗炎抗菌、抗氧化、抗腫瘤及保護心肌再灌注損傷等［8］。研究表明，槲皮素對SARS-CoV 3CL 有抑制作用［9］。槲皮素可顯著地抑制脂多糖（LPS）誘導RAW264.7 細胞后NO、TNF-α、IL-1β以及IL-6 含量的升高，從而起到抗炎效果［10］。研究表明，槲皮素與ACE2 有良好的結(jié)合力，可通過抑制ACE、AngⅡ，促進ACE2 水平來抑制心室重構(gòu)和纖維化［11］。賈慶運等［12］的研究表明，槲皮素可抑制NF-κB 的 磷 酸 化，下 調(diào)TNF-α 誘 導 的MH7A 細 胞IL-1β、IL-6、IL-8 的表達。因此推測，槲皮素可能通過抑制炎癥反應的發(fā)生，保護心肌再灌注損傷等改善重型新冠肺炎患者急性呼吸窘迫、多器官衰竭等臨床癥狀。山奈酚可通過Erk 和Nf-κB 途徑調(diào)節(jié)氧化應激、炎癥和細胞凋亡。柚皮素可通過抑制NLRP3 炎癥小體的激活，降低炎癥水平［13］。β-谷甾醇可顯著抑制LPS/Gal N 誘導的Toll 樣受體4（TLR4）和NF-κB 的高表達，降低了TNF-α、IL-1β和IL-6 的水平［14］，抑制炎癥反應的發(fā)生，從而減少因新冠肺炎引起的肺損傷的發(fā)生。

通過PPI 網(wǎng)絡(luò)，篩選出四逆加人參湯治療COVID-19 的 關(guān) 鍵 靶 點7 個，分 別 為IL-6、MAPK8、MAPK3、MAPK1、TP53、TNF、CASP3。研 究 表明，SARS-CoV-2 與ACE2 過度結(jié)合，機體的過度免疫應答，產(chǎn)生了大量細胞因子，從而引起細胞因子風暴，導致急性肺損傷（ALI）、急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）及多器官衰竭等，所以調(diào)節(jié)炎癥反應及免疫應答至關(guān)重要［15］。作為炎性細胞因子，IL-6、TNF 通過自分泌、旁分泌及全身作用等方式參與炎癥反應而發(fā)揮疾病治療作用。IL-6 是一種炎癥反應的促發(fā)劑，它可以通過誘導B 細胞分化、產(chǎn)生抗體及T 細胞增殖分化，從而參與免疫應答，還可通過激活NF-κB 信號通路，促進炎癥因子的釋放，從而導致細胞因子風暴的產(chǎn)生［16］。TNF 可促進內(nèi)皮細胞粘附因子的表達分泌并促使白細胞與之黏著，還能激活間質(zhì)組織蛋白水解酶的釋放及中性粒細胞的聚集，從而發(fā)揮疾病治療作用［17］。馮碧紅等［18］的研究表明，肺部被流感病毒感染后，中性粒細胞和單核細胞被致炎因子激活，釋放炎性細胞因子如TNF、IL-6 等，促使機體炎癥反應的發(fā)生及組織的損傷。MAPK8、MAPK3、MAPK1 均屬于絲裂原蛋白活化激酶（MAPK）家族。MAPK 是一個多功能的信號家族，包括三大主要的功能家族，即ERKs、JNKs 和p38。MAPK 可被上游激酶活化并磷酸化，從而活化下游因子，發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞增殖、分化及死亡的作用［19］。研究表明，MAPK 是ALI 中炎癥反應的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，通過靶向MAPK1 表達可減弱LPS誘導的ALI［20］。程海飛等［21］的研究表明，ALI 過程中MAPK 信號通路通過調(diào)節(jié)下游產(chǎn)物活性，影響炎癥細胞黏附血管內(nèi)皮，在炎癥部位激活并釋放炎癥因子以及凋亡過程，調(diào)控MAPK 信號通路的活性可影響ALI 進展。TP53 作為一種腫瘤抑制因子，可調(diào)節(jié)細胞周期，起到炎癥抑制作用［22］。研究發(fā)現(xiàn)，肺泡Ⅱ型上皮細胞被BCG 感染時，P53 可通過抑制TNF-α 介 導 細 胞 死 亡［23］。王 媛 等［24］的 研 究 發(fā) 現(xiàn)，BCG 感染A549 細胞時，p53 信號通路中的p53 協(xié)同p300 來 抑 制NF-κB、TLR-4 和TRAF6 的 活 化 及 負調(diào)控TNF-α、IFN-γ、IL-6 和IL-8 的分泌，從而抵抗MTB 的侵染。CASP3 是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，Sun 等［25］的研究表明，抑制CASP3 的激活可減少PRRSV 誘導的細胞凋亡。以上研究表明，四逆加人參湯可通過對以上因子的調(diào)節(jié)參與炎癥反應介導炎性因子的釋放，調(diào)節(jié)機體免疫增加機體對病毒的抵抗，從而介導機體ALI 及ARDS進程。

GO 富集分析涉及炎癥反應、細胞對脂多糖的反應、LPS 介導的信號通路、外源性凋亡信號通路、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細胞因子活性、趨化因子活性，血紅素結(jié)合等。炎癥反應是機體應對刺激產(chǎn)生TNF、IL、趨化因子、IFN 等促炎性因子的一種反應，可因過度激活而產(chǎn)生細胞因子風暴，從而導致組織器官損傷、器官衰竭。研究結(jié)果提示，COVID-19 的始動因素是SARS-CoV-2 感染。研究人員推測SARS-CoV-2 感染后激活免疫細胞，釋放TNF-α、IL-1、干擾素、趨化因子等，介導大量免疫細胞向肺組織聚集浸潤，同時激活細胞信號轉(zhuǎn)導通路，啟動瀑布式炎癥級聯(lián)反應，釋放大量細胞因子，并不斷激活更多的炎癥細胞，形成惡性循環(huán)，最終導致細胞因子風暴［26］。SARS-CoV-2 作為一種RNA 病毒，通過對RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，從而影響RNA 病毒的復制［27］。LPS 可與Toll樣受體4 結(jié)合，通過NF-κB 信號通路介導炎性因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的表達，其誘導的炎癥反應可促進ALI 的發(fā)生發(fā)展［28，29］。基于KEGG 信號通路并篩選得到結(jié)核、甲型流感、TNF 信號通路、MAPK信號通路、Toll 樣受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路、HIF-1 信 號 通 路、NF-κB 信 號 通 路 等。TNF 信號通路在炎癥反應及抑制細胞因子風暴中起重要作用［30］。MAPK 信號通路及TNF 信號通路可通過減輕過度免疫應答從而減輕炎癥反應。Toll 樣受體是一種信號分子識別受體，可通過調(diào)節(jié)免疫從而產(chǎn)生抗病毒作用，還能通過誘導多種炎癥因子的分泌從而參與炎癥反應［31］，此外與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［32］。NF-κB 信號通路參與炎癥反應、免疫應答及細胞凋亡等多個過程，NF-κB 的活化可促進皰疹病毒的復制［33，34］。四逆加人參湯通過對以上生物過程及通路的調(diào)節(jié)參與機體炎癥反應及免疫調(diào)節(jié)過程，從而介導機體內(nèi)細胞因子風暴的產(chǎn)生，影響ARDS 及多器官衰竭進程。

本研究通過運用網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，初步分析了四逆加人參湯治療新冠肺炎的作用機制。四逆加人參湯含有槲皮素、山奈酚、柚皮素、β-谷甾醇等活性成分，可通過TNF 信號通路、MAPK 信號通路、Toll 樣受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路、HIF-1 信號通路等通路作用于IL-6、MAPK8、MAPK3、MAPK1、TP53、TNF、CASP3 等靶點，富集在炎癥反應、細胞對脂多糖的反應、脂多糖介導的信號通路、外源性凋亡信號通路、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細胞因子活性、趨化因子活性，血紅素結(jié)合等多個生物過程。由此可得知，四逆加人參湯治療新冠肺炎是多成分、多通路、多靶點共同作用的結(jié)果。然而，本研究僅從理論上分析其機制，中藥劑量及煎煮、新冠肺炎數(shù)據(jù)庫尚不完善等問題可能會對本結(jié)果造成一定的影響，接下來還需進一步實驗驗證，從而為COVID-19 的中醫(yī)藥治療提供更加直接有力的證據(jù)。