冷 雪 劉 萍 陳 楨 周 亮

（1 遂寧市中醫(yī)院病理科，遂寧 629000；2 瀘州市人民醫(yī)院病理科，瀘州 646000；3 遂寧市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，遂寧 629000；4 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，成都 610065）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是中國第三大與癌癥相關(guān)的死亡原因[1]。病因包括乙型/丙型肝炎病毒（hepatitis B virus/hepatitis C virus，HBV/HCV）感染、慢性酒精中毒、黃曲霉毒素、吸煙、肥胖和糖尿病等[2]。術(shù)后肝內(nèi)或肝外轉(zhuǎn)移的高發(fā)生率仍然是肝細(xì)胞癌難以治愈的關(guān)鍵原因之一[3]。已發(fā)現(xiàn)多個基因靶點(diǎn)或啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與肝細(xì)胞癌的預(yù)后密切相關(guān)[4]。Wang等[5]通過對肝細(xì)胞癌重組cDNA表達(dá)文庫的血清學(xué)分析，鑒定了肝細(xì)胞癌相關(guān)抗原587（hepatocellular carcinoma-associated antigen 587，HCA587）基因，其序列與黑素瘤相關(guān)抗原C2（melanoma-associated antigen C2，MAGEC2）的序列相同。最新的研究證據(jù)顯示，HCA587能夠通過TATA盒結(jié)合蛋白相關(guān)因子9（TATA-box binding protein associated factor 9，TAF9）相互結(jié)合，并發(fā)揮致癌功能[6]。HCA587與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)[7-8]。王萬祥等[9]認(rèn)為，HCA587 mRNA作為腫瘤標(biāo)志物來檢測循環(huán)肝癌細(xì)胞，可用于肝細(xì)胞癌的輔助診斷和作為監(jiān)測復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的指標(biāo)。然而，到目前為止，幾乎沒有關(guān)于HCA587的上調(diào)與其啟動子區(qū)甲基化的相關(guān)報(bào)道。本研究假設(shè)HCA587啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)失調(diào)與HCA587的上調(diào)相關(guān)，并因此而促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)通過臨床肝細(xì)胞癌組織檢測HCA587的表達(dá)和啟動子區(qū)甲基化變化，體外檢測HCA587對肝細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲的影響。

1 材料和方法

1.1 患者和組織樣本

從2016年12月至2019年12月，于遂寧市中醫(yī)院病理科收集114例接受手術(shù)治療肝癌病例的肝細(xì)胞癌組織和癌旁非癌組織。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：診斷為肝細(xì)胞癌的患者；術(shù)前無放療或化學(xué)療法。排除標(biāo)準(zhǔn)如下：手術(shù)前接受過放療或化療的患者；另外，本研究從114例中隨機(jī)選擇3例接受手術(shù)治療，收集這3例肝細(xì)胞癌新鮮組織以及石蠟包埋組織和各自匹配的非癌組織，用于免疫組織化學(xué)和免疫印跡檢測。本研究記錄每位患者年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、原發(fā)腫瘤局部淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（tumor node metastasis，TNM）分期等信息。

1.2 試劑與耗材

人肝細(xì)胞癌細(xì)胞BEL-7404購于武漢普諾賽生命科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；TRIzol 試劑購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司；HCA587一抗購于美國Abcam公司；甲基化抑制劑5-Azacytidine購于上海浩然生物技術(shù)有限公司；HCA587的重組高表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-HCA587）和其空載體（empty vector，EV）購于上海吉瑪公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen（ThermoFisher Scientific）公司；實(shí)時定量PCR（real time-qPCR）引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；EasyBlot購于美國GeneTex公 司；BeaverBeads? GSH-GST蛋 白純化磁珠購于蘇州海貍公司；Transwell 小室購自Corning公司（美國）；Matrigel 基底膜基質(zhì)購自美國BD公司。

1.3 RT-PCR檢測肝細(xì)胞癌組織中HCA587的表達(dá)

使用TRIzol一步法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，以GAPDH為內(nèi)參基因，進(jìn)行熒光定量PCR檢測。HCA587基因的熒光定量PCR引物見表1。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性6 min；97℃變性10 s，55℃退火20 s，70℃延伸35 s，共38個循環(huán)。每個樣本重復(fù)檢測2次。mRNA相對表達(dá)量以2-△△Ct表示。

表1 HCA587基因引物序列

1.4 HCA587基因啟動子區(qū)甲基化檢測

提取肝細(xì)胞癌組和癌旁組中的DNA，每組DNA樣品均進(jìn)行甲基化敏感酶HhaⅠ酶切、甲基化依賴酶McrBC酶切處理，并以非酶切樣本作為對照。甲基化敏感酶HhaⅠ特異性識別，并切開非甲基化的CGCG位點(diǎn)，甲基化依賴酶McrBC特異性識別，并酶切PumCG（N40-3000）位點(diǎn)。酶切體系為：限制酶4 μL，NEB buffer 5 μL，1 mmol/L GTP，BSA 100 μg/mL，DNA 4 μg，用去離子H2O補(bǔ)至總體積50 μL。37℃ 酶切16 h，65℃ 20 min滅活酶活性。

在HCA587基因CpG島區(qū)域設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增區(qū)域同時含有甲基化敏感酶和甲基化依賴酶的酶切位點(diǎn)。熒光定量PCR反應(yīng)總體系為15 μL：酶切產(chǎn)物2 μL，HCA587-MF和HCA587-MR引物各1 μL，2×PCR master mix 3.0 μL，dNTP 1 μL，去離子H2O 8 μL。結(jié)果判斷：若DNA樣本HhaⅠ酶切后熒光定量PCR檢測到特異片段的擴(kuò)增，而McrBC酶切后無擴(kuò)增，則判斷此樣品存在甲基化；若HhaⅠ酶切后無擴(kuò)增，而McrBC酶切后擴(kuò)增陽性，則判斷為無甲基化。Ct值≥35個循環(huán)認(rèn)為無擴(kuò)增。

1.5 免疫印跡檢測

取1～3號患者肝細(xì)胞癌標(biāo)本，冷藏研磨，用磷酸鹽緩沖液清洗后加入裂解液，置于EP管中，后離心（4 ℃，13 000 r/min，20 min）。取上清液，用牛血清白蛋白法測定蛋白濃度。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用電轉(zhuǎn)（恒電流200 mA，120 min，冰水?。撝谭鄯忾]2 h，加入HCA587一抗（1∶500）后在4 ℃下孵育過夜。次日 Tris-HCl 緩沖液漂洗3次后，加入二抗孵育 1 h，再用Tris-HCl 緩沖液漂洗3次，用化學(xué)發(fā)光顯色、拍照，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

BEL-7404培養(yǎng)采用10%胎牛血清配制的RPMI-1640培養(yǎng)基，并置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前1 d將BEL-7404細(xì)胞接種于24孔板中。嚴(yán)格根據(jù)合成商提供的說明，使用5-Azacytidine、pcDNA3.1-HCA587及EV對BEL-7404進(jìn)行分別處理，處理時間為24 h。

1.7 免疫沉淀

根據(jù)制造商的說明，采用純蛋白組蛋白磁珠系統(tǒng)進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。采用HCA587和rIgG制備抗體磁珠。隨后按照免疫印跡方法進(jìn)行結(jié)果分析。使用EasyBlot作為二抗抗體。

1.8 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的細(xì)胞（1×105）接種于未鋪Matrigel膠的小室，500 μL的完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清）加入下室；在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h后取出小室，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，使用棉簽棒擦拭上室中未穿膜細(xì)胞；倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個視野的細(xì)胞計(jì)數(shù)，取均數(shù)。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的細(xì)胞（1×105）接種于預(yù)先鋪有25 μL的Matrigel 膠小室，其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)一致。使用棉簽棒擦拭上室中未穿膜細(xì)胞；倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個視野的細(xì)胞計(jì)數(shù)，取均數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌患者臨床病理指標(biāo)

剔除拒絕入組及不符合入組條件者，本實(shí)驗(yàn)入組114例確診的HCC患者，年齡范圍為48～82歲（中位數(shù)為67歲），年齡為（47.22±15.36）歲，男性為（46.57±11.69）歲，女性為（48.25±19.10）歲；男性76人（66.7%），女性38人（33.3%）。其中，非吸煙患者占（27人）23.7%，吸煙患者占（87人）76.3%。根據(jù)肝細(xì)胞癌的TNM 分期，患者病理腫瘤分期的分布為Ⅰ期15例，Ⅱ期39例，Ⅲ期51例，Ⅳ期9例（表2）。

表2 肝細(xì)胞癌患者病理特征

2.2 HCA587的表達(dá)

應(yīng)用RT-PCR法研究肝細(xì)胞癌患者HCA587基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)，選擇肝細(xì)胞癌組織及匹配的癌旁非腫瘤組織。結(jié)果顯示，與癌旁非癌組織組比，肝細(xì)胞癌組織中HCA587的mRNA高水平表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖1A、B）。

圖1 HCA587 mRNA的表達(dá)。

2.3 肝細(xì)胞癌組織中HCA587翻譯水平和表達(dá)變化

HCA587在肝細(xì)胞癌組織中的蛋白表達(dá)檢測，免疫印跡檢測結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果一致，與癌旁非癌組織組比，肝細(xì)胞癌組織中HCA587的蛋白水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌組中的HCA587陽性率高于癌旁非癌組織（圖2B）。

圖2 HCA587在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)。

2.4 HCA587啟動子區(qū)甲基化水平

NT組及HCC組基因HCA587基因啟動子區(qū)CpG島甲基化水平分布圖見圖3，HCC組HCA587啟動子區(qū)CpG島平均甲基化率為（15.61±6.85）%，NT組平均甲基化率為（19.89±5.22）%，HCC組HCA587基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化水平較NT組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖3 HCA587基因啟動子區(qū)甲基化檢測結(jié)果，HCA587基因啟動子區(qū)CpG島甲基化水平分布圖.

2.5 5-Azacytidine抑制HCA587的甲基化，并促進(jìn)HCA587的mRNA表達(dá)

使用5-Azacytidine處理HCC細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，HCA587的 mRNA表達(dá)較對照組顯著增加（表3，P<0.05）；但是，HCA587的甲基化水平較對照組顯著降低（表3，P<0.05）。

表3 5-Azacytidine 對HCC細(xì)胞中HCA587的mRNA和甲基化水平影響（n=3，±s）

表3 5-Azacytidine 對HCC細(xì)胞中HCA587的mRNA和甲基化水平影響（n=3，±s）

*P<0.05 vs對照組

組別 HCA587 mRNA HCA587甲基化對照組 2.669±0.547 1.000±0.012 5-Azacytidine 12.536±2.997* 0.651±0.324*

2.6 5-Azacytidine 促進(jìn)HCA587和TAF9的結(jié)合

使用5-Azacytidine處理肝細(xì)胞癌細(xì)胞。使用免疫沉淀法研究細(xì)胞中HCA587和TAF9的直接作用。免疫印跡檢測結(jié)果表明，與5-Azacytidine處理前比，HCA587和TAF9的免疫沉淀復(fù)合物增加（圖4A、B）。結(jié)果表明，肝細(xì)胞癌細(xì)胞中5-Azacytidine可促進(jìn)HCA587和TAF9的結(jié)合。

圖4 5-Azacytidine 處理肝細(xì)胞癌細(xì)胞后，使用免疫沉淀技術(shù)檢測HCA587和TAF9的結(jié)合。IP：免疫沉淀。

2.7 5-Azacytidine或過表達(dá)HCA587上調(diào)HCC細(xì)胞的遷移和侵襲

進(jìn)一步檢測5-Azacytidine及pcDNA3.1-HCA587處理肝細(xì)胞癌細(xì)胞對細(xì)胞遷移和侵襲的影響（圖5A、B），與對照組比，5-Azacytidine促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)量和侵襲細(xì)胞數(shù)量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.018）（圖5A、B），過表達(dá)HCA587促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，與空載體組比，pcDNA3.1-HCA587組的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖5 Twanswell小室法檢測過表達(dá)HCA587對HCC細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)的影響。A1～E1：Transwell細(xì)胞遷移結(jié)果（A1～D1）及遷移細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)柱形圖（E1），標(biāo)尺=20μm；A2～E2：Transwell細(xì)胞侵襲結(jié)果（A2～D2）及侵襲細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)柱形圖（E2），標(biāo)尺=20 μm。*P<0.05 vs對照組；#P<0.05 vs 空載體組。

3 討論

肝細(xì)胞癌是五大最常見的癌癥類型之一，具有高復(fù)發(fā)率，缺乏有效的化療和放療手段[10]，多種致癌信號通路的失調(diào)是肝細(xì)胞癌的關(guān)鍵特征，本研究認(rèn)為這些失調(diào)的信號機(jī)制中可能也包括HCA587啟動子區(qū)甲基化改變和HCA587/MAGE-C2-TAF9信號調(diào)節(jié)機(jī)制。

HCA587/MAGEC2是一種腫瘤-睪丸（cancer testis，CT）抗原，在多種惡性腫瘤中表達(dá)，包括肝細(xì)胞癌、黑素瘤、膀胱癌、頭頸癌、乳腺癌和肺癌[11]。先前的研究主要集中在確定HCA587/MAGEC2作為腫瘤免疫治療靶標(biāo)的潛力；且已證明HCA587/MAGEC2具有免疫原性，可在患有HCA587/MAGEC2表達(dá)的腫瘤患者中誘發(fā)自發(fā)性抗體和T細(xì)胞免疫反應(yīng)[7，12-13]。而且先前的研究表明，HCA587/MAGEC2在癌細(xì)胞中的表達(dá)可能介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能[14-16]。肝細(xì)胞癌等惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是預(yù)后差的關(guān)鍵原因，先前的報(bào)道表明HCA587/MAGEC2還可通過與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and transcriptional activator 3，STAT3）結(jié)合來促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[16]，這與本研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果顯示，肝細(xì)胞癌細(xì)胞中過表達(dá)HCA587后，細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力均明顯上調(diào)，意味著HCA587可能是促進(jìn)肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵抗原之一。

本研究結(jié)果表明，肝細(xì)胞癌細(xì)胞中TAF9能明顯與HCA587/MAGEC2進(jìn)行結(jié)合，該結(jié)果與先前的研究一致，TAF9是HCA587/MAGEC2的結(jié)合伴侶。TAF9和HCA587/MAGEC2共定位于細(xì)胞核中，而且通過免疫沉淀試驗(yàn)證明了HCA587/MAGEC2與TAF9在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性相互作用[6]，TAF9是一種具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延伸調(diào)控因子和細(xì)胞周期控制關(guān)鍵基因的基因，介導(dǎo)G1/S周期過渡、細(xì)胞極性、細(xì)胞完整性[17]。因此，HCA587與TAF9相互作用可能與腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲能力有重要關(guān)聯(lián)。Nault等[18]報(bào)道，TAF9表達(dá)上調(diào)與通過切除術(shù)治療的肝細(xì)胞癌患者預(yù)后差有關(guān)。此外，還證明了TAF9與鋅指蛋白Gli相互作用并調(diào)節(jié)Gli活性，用干擾Gli/TAF9相互作用的抑制劑治療可抑制腫瘤生長[19]。在本研究中，再次證實(shí)了TAF9與HCA587/MAGEC2的結(jié)合，肝細(xì)胞癌細(xì)胞中TAF9與HCA587/MAGEC2的結(jié)合可能對腫瘤細(xì)胞的生長、周期、轉(zhuǎn)移等具有調(diào)節(jié)作用，但是仍需進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

表觀遺傳學(xué)是基于基因表達(dá)水平的信息遺傳，而腫瘤已被確定為表觀遺傳疾病[20]。近年來研究證實(shí)，表觀遺傳變化引起染色體失去穩(wěn)定性、基因非法表達(dá)、非整倍性和突變，這些均可導(dǎo)致抑癌基因的轉(zhuǎn)錄沉默[21]。在人類基因組中，CpG二核苷酸不協(xié)調(diào)地分布形成了富含CpG的區(qū)域。CpG島異常甲基化是常見的表觀遺傳修飾，這是組織特異性而非物種特異性。DNA甲基化對多種細(xì)胞功能具有一定影響，比如細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移。本研究結(jié)果顯示，人類肝細(xì)胞癌中的HCA587的DNA啟動子區(qū)的甲基化出現(xiàn)異常，研究表明包括HCA587在內(nèi)的多個基因腫瘤中以高表達(dá)和低甲基化狀態(tài)存在，并通過轉(zhuǎn)錄激活促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[22]。因此，推測HCA587的低甲基化和高表達(dá)在肝細(xì)胞癌中具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與推測的一致，觀察的肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織中HCA587的表達(dá)大范圍上調(diào)，而且通過免疫印跡和免疫組織化學(xué)法驗(yàn)證了患者組織中HCA587高表達(dá)。通過研究HCA587的表觀遺傳調(diào)控和功能，顯示HCA587在人肝細(xì)胞癌樣本中表達(dá)水平較高，且甲基化水平較低，體外證實(shí)HCA587的高表達(dá)受啟動子區(qū)域甲基化的調(diào)節(jié)。這些數(shù)據(jù)表明，HCA587的低甲基化和高表達(dá)可作為肝細(xì)胞癌早期檢測標(biāo)記；另外，在體外使用甲基化抑制劑5-Azacytidine后，肝細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增加。為了驗(yàn)證甲基化抑制后對HCA587功能的影響，觀察了5-Azacytidine對HCA587表達(dá)的影響，結(jié)果顯示HCA587的mRNA水平明顯增加，而體外使用pcDNA3.1重組質(zhì)粒過表達(dá)HCA587后，同樣增加了肝細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，表明HCA587的CpG區(qū)甲基化改變對人類肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移可能具有重要意義。

本研究仍有稍許不足，首先樣本量仍需進(jìn)一步擴(kuò)大，明確HCA587的甲基化在肝細(xì)胞癌不同分期中的變化，在體內(nèi)分析HCA587的表達(dá)和甲基化水平與患者5年生存期的相關(guān)性；另外，仍需進(jìn)一步明確TAF9與HCA587/MAGEC2結(jié)合可能對腫瘤細(xì)胞的生長、周期、轉(zhuǎn)移等影響。

綜上所述，本研究目前的工作表明，HCA587基因在肝細(xì)胞癌中具有高表達(dá)和低甲基化趨勢。而且，HCA587表達(dá)和甲基化水平改變是調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制之一。本研究為肝細(xì)胞癌的治療靶點(diǎn)研究提供了有價值的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。