張曉丹 徐 毅 杜德奇 郭 瑩 王魯文

（鄭州市婦幼保健院，1 產(chǎn)科，2 婦科，鄭州 450000；3 鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科，鄭州 450000）

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA） 大約占人類基因組的98%，其中，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度超過200個核苷酸的非編碼序列[1-2]。某些lncRNA在惡性腫瘤組織或細胞系中具有異常表達，可作為早期診斷的參考、臨床治療的靶點或預(yù)后的標(biāo)志，比如NEAT1[3]、HAGLROS[4]、TP73-AS1[5]、VPS9D1-AS1[6]等。通過多種途徑參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，在細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲、遷移、凋亡等方面發(fā)揮作用。因此，lncRNA在腫瘤研究中具有價值和潛力。卵巢癌是死亡率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，5年生存率不超過50%[7]。僅15%患者在早期或局部階段被診斷，治療后藥物抵抗性及復(fù)發(fā)率較高[8]，尋找新的生物標(biāo)志物來協(xié)助卵巢癌早期診斷和靶向治療迫在眉睫。lncRNA在卵巢癌發(fā)生和發(fā)展中起著促進或抑制作用，干擾lncRNAs的異常表達可有效逆轉(zhuǎn)腫瘤的進展。Han等[9]的研究顯示lncRNA SOX2OT在卵巢癌中促進腫瘤細胞增殖和活性，Edward等[10]研究顯示干擾lncRNA HOXA11-AS具有抑制上皮性卵巢癌致癌表型的作用，但lncRNA MNX1-AS1對卵巢癌的影響尚未報道。因此，本實驗探討干擾lncRNA MNX1-AS1對卵巢癌細胞的干樣特性、氧化應(yīng)激以及線粒體功能損傷的影響，以期為卵巢癌的臨床診斷、治療提供有價值的參考。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑儀器

人卵巢癌細胞SKOV3購自中國科學(xué)院上海細胞庫；RPMI1640培養(yǎng)液、干細胞無血清培養(yǎng)基（MSC Basal Medium）、10%胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（美國Thermo Fisher公司）；LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑（武漢普諾賽生命科技有限公司）；陰性對照質(zhì)粒、沉默表達序列質(zhì)粒（山東維真生物科技有限公司）；SDS-PAGE蛋白凝膠、RIPA細胞裂解液，TRIzol試劑，PCR試劑盒（南京金斯瑞生物科技有限公司）；總蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量測定試劑盒（上海信裕生物技術(shù)有限公司）；羊抗鼠OCT4抗體、鼠抗人SOX2抗體、鼠抗人ABCG2抗體（美國Sigma-Aldrich公司）；丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、活性氧（ROS）試劑盒（上海晶抗生物工程有限公司）；JC-1線粒體膜電位試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

Rt2100c酶標(biāo)檢測儀（BioTeK美國伯騰儀器公司）；CytoFLEX流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；DMi8倒置熒光顯微鏡（德國徠卡公司）；BPN-80CRH（uv） CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒儀器有限公司）；BBS-SSC超凈工作臺（濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）；JIDI-16R臺式多用途高速冷凍離心機（廣州吉迪儀器有限公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

將SKOV3細胞轉(zhuǎn)移至含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞生長達90%以上，消化處理后，調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

將消化稀釋后的SKOV3細胞隨機分成5組：對照組、陰性對照組（shRNA-NC）及3個干擾組（MNX1-AS1-shRNA1、MNX1-AS1-shRNA2、MNX1-AS1-shRNA3）。其中，空白組加等體積培養(yǎng)液，其余4組分別使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染不同序列質(zhì)粒，細胞培養(yǎng)48 h 后，進行后續(xù)實驗。

1.3 RT-PCR檢測RNA MNX1-AS1的表達

取方法1.2中轉(zhuǎn)染的對數(shù)生長期細胞，經(jīng)消化、離心、重懸后，稀釋為1×106/mL，接種于96孔板，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱24 h。采用TRIzol試劑提取細胞樣品中的總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄，加入相應(yīng)引物。用2-△△Ct法計算RNA MNX1-AS1的相對表達水平。

將生長良好的細胞，進行消化離心，用PBS清洗后轉(zhuǎn)移至干細胞培養(yǎng)基，重懸細胞，并計數(shù)，經(jīng)細胞鋪板后，培養(yǎng)10 d，在顯微鏡下觀察成球數(shù)量及狀態(tài)。

1.4 免疫印跡檢測干細胞標(biāo)記物蛋白OCT4、SOX2、ABCG2的表達

取方法1.2中對數(shù)生長期細胞，PBS洗滌，加入裂解液，收集上清液。按照BCA試劑盒說明，進行蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，選用OCT4、SOX2、ABCG2相應(yīng)抗體，進行一抗、二抗、顯色等操作。

1.5 試劑盒檢測氧化應(yīng)激標(biāo)記物MDA、SOD的含量

取方法1.2中對數(shù)生長期細胞，用PBS重懸細胞，反復(fù)凍融3次破壞細胞膜，分別按照MDA、SOD試劑盒說明進行操作。

1.6 熒光探針檢測ROS的含量

按照1∶1 000比例用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFHDA，取方法1.2中收集好的細胞懸浮，稀釋為1×106個/mL，置于培養(yǎng)箱中孵育（37℃，20 min），洗滌3次，探針標(biāo)記完成后，在激發(fā)波長503 nm，發(fā)射波長530 nm附近，用熒光顯微鏡進行觀察。

1.7 流式細胞儀檢測線粒體膜電位的變化

取方法1.2中收集好的細胞，離心后棄上清，根據(jù)線粒體膜電位檢測試劑盒說明進行操作，加入JC-1熒光探針染液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱20 min，洗去染色液，用流式細胞儀檢測。

1.8 免疫印跡檢測線粒體損傷標(biāo)記蛋白Bax/Bcl-2、cleaved cas3、cas3、c-Myc的表達

操作同方法1.4，選用Bax、Bcl-2、cleaved cas3、cas3、c-Myc相應(yīng)抗體。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用±s表示，行單因素方差分析（One-Way ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同shRNA序列干擾lncRNA MNX1-AS1表達的影響

與對照組相比，shRNA-NC組RNA MNX1-AS1表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與shRNA-NC組相比，3個干擾組RNA MNX1-AS1表達水平均降低（P<0.05，圖1），其中MNX1-AS1-shRNA3組干擾最為顯著，選擇此組為后續(xù)實驗干擾組。

圖1 不同shRNA序列干擾lncRNA MNX1-AS1表達的影響

2.2 干擾lncRNA MNX1-AS1對卵巢癌干細胞成球的影響

與對照組相比，shRNA-NC組干細胞成球差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與shRNA-NC組相比，MNX1-AS1-shRNA3干擾組細胞成球數(shù)量及直徑顯著減少（P<0.05，圖2）。結(jié)果提示，干擾lncRNA MNX1-AS1能抑制SKOV3干細胞特性，能夠降低腫瘤細胞的自我更新及分化，緩解卵巢癌病程。

圖2 各實驗組對卵巢癌干細胞成球的影響

2.3 干擾lncRNA MNX1-AS1對卵巢癌干細胞標(biāo)志物蛋白表達的影響

與對照組相比，shRNA-NC組標(biāo)志物表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；與shRNA-NC組相比，MNX1-AS1-shRNA3干擾組的OCT4、SOX2、ABCG2表達水平均降低（P<0.05，圖3）。結(jié)果提示，干擾lncRNA MNX1-AS1能抑制SKOV3干細胞特性，在一定程度上緩解卵巢癌病程，與結(jié)果2.2的一致。

圖3 各實驗組對卵巢癌干細胞標(biāo)志物蛋白表達的影響

2.4 干擾lncRNA MNX1-AS1對卵巢癌細胞線粒體功能的影響

與對照組相比，shRNA-NC組氧化應(yīng)激標(biāo)記物水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與shRNA-NC組相比，MNX1-AS1-shRNA3干擾組MDA含量顯著升高、SOD活性顯著降低（P<0.05，圖4A、B，見封三）；MNX1-AS1-shRNA3干擾組細胞熒光強度增強，活性氧水平顯著升高（P<0.05，圖4C、D，見封三）。實驗提示干擾lncRNA MNX1-AS1誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，促進SKOV3細胞線粒體損傷。

與對照組相比，shRNA-NC組卵巢癌線粒體指標(biāo)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與shRNA-NC組相比，MNX1-AS1-shRNA3干擾組紅色細胞轉(zhuǎn)向綠色熒光的數(shù)目增多，綠色熒光細胞比例較大（P<0.05，圖4E、F，見封三），表明線粒體的膜電位下降；MNX1-AS1-shRNA3干擾組Bax/Bcl-2、cleaved cas3/cas3表達水平顯著增加，c-Myc表達顯著降低（P<0.05，圖4G、H，見封三）。提示干擾lncRNA MNX1-AS1促進SKOV3細胞線粒體損傷，對卵巢癌有緩解作用。

圖4 各實驗組對卵巢癌細胞線粒體功能的影響

3 討論

近年來，腫瘤學(xué)領(lǐng)域的研究趨向于分子機制以及分子水平的臨床診斷、治療。其中，lncRNAs被證實與多種惡性腫瘤的生物學(xué)功能有關(guān)。Chen等[11]的研究表明lncRNA BLACAT1可作為子宮癌診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。Huang等[12]的研究顯示lncRNA PTTG3P通過上調(diào)PTTG1和激活PI3K/AKT信號通路促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，可作為肝癌預(yù)后的標(biāo)志物；Xia等[13]指出二甲雙胍可以通過破壞lncRNA MALAT1/miR-142-3p的海綿效應(yīng)，抑制宮頸癌細胞增殖。

越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)在卵巢癌細胞中參與基因調(diào)控，阻斷或促進癌癥發(fā)展。Zeng等[14]報道lncRNA AB073614的上調(diào)可作為上皮性卵巢癌預(yù)后的標(biāo)志因子，并在體內(nèi)外促進腫瘤生長；余心華等[15]研究表明lncRNA ANRIL靶向miR-214的表達調(diào)控卵巢癌細胞的增殖與侵襲行為。本實驗探討干擾lncRNA MNX1-AS1對卵巢癌細胞的干樣特性、氧化應(yīng)激以及線粒體功能損傷的影響。

ABCG2轉(zhuǎn)運蛋白維持干細胞穩(wěn)定性，SOX2轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)成體干細胞轉(zhuǎn)化為多功能細胞，OCT4蛋白維持干細胞多樣性和自我更新的能力[15]。Wu等[16]報道干擾 lncRNA MALAT1通過增強YAP從細胞核到細胞質(zhì)的易位來抑制卵巢癌干細胞的干性。結(jié)果提示，干擾lncRNA MNX1-AS1能減少干細胞成球數(shù)量及直徑，降低標(biāo)志物表達水平，抑制SKOV3干細胞特性，降低腫瘤細胞的自我更新及分化，緩解卵巢癌病程，與上述研究一致。

SOD是重要的抗氧化酶，能夠清除超氧自由基[17]。自由基與脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，最終產(chǎn)物是MDA，具有細胞毒性。因此MDA反映膜脂過氧化程度及膜系統(tǒng)損傷程度[18]。通過調(diào)節(jié)ROS水平，干擾細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，促進膜系統(tǒng)受損致使腫瘤細胞程序性死亡，是治療癌癥的有效方法[19]。本實驗顯示，MNX1-AS1-shRNA3干擾組MDA含量及ROS活性顯著升高、SOD活性顯著降低，提示干擾lncRNA MNX1-AS1誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，促進SKOV3細胞線粒體損傷。

當(dāng)Bax高表達或Bcl-2低表達時線粒體會釋放細胞色素c激活凋亡[20]。因此，Bax/Bcl-2不僅是線粒體損傷的指標(biāo)，也是決定細胞凋亡趨勢的標(biāo)志。此外，活化的caspase 3可促使下游的凋亡相關(guān)蛋白活化，進一步破壞線粒體生理結(jié)構(gòu)完整[21]。Liu等[22]的研究顯示lncRNA MEG3低表達誘導(dǎo)Bax/Bcl-2、cleaved cas3/cas3上調(diào)，促使膀胱癌細胞線粒體損傷，促進其凋亡。本實驗MNX1-AS1-shRNA3干擾組綠色熒光細胞比例增加，表明線粒體的膜電位下降；Bax/Bcl-2、cleaved cas3/cas3表達水平顯著增加，c-Myc表達顯著降低。提示干擾lncRNA MNX1-AS1促進SKOV3細胞線粒體損傷、誘導(dǎo)其凋亡，對卵巢癌有緩解作用。

綜上，干擾lncRNA MNX1-AS1抑制卵巢癌細胞的干樣特性，減少腫瘤細胞的自我更新；增加 SKOV3細胞內(nèi)ROS積聚，降低膜電位，致使線粒體損傷加重，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。因此，干擾lncRNA MNX1-AS1對SKOV3細胞抑制效果顯著，具有靶向治療卵巢癌的潛力。