李 紅 李雅慧

（1 寧夏吳忠市人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，全科醫(yī)學(xué)科，吳忠 751100；2 解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四二醫(yī)院內(nèi)分泌風(fēng)濕免疫科，銀川 750004）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是急性呼吸窘迫綜合征的早期表現(xiàn)，病死率高達(dá)30%～40%，在老年患者中甚至高達(dá)60%[1]。目前認(rèn)為，巨噬細(xì)胞是參與ALI進(jìn)展的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，其對(duì)環(huán)境刺激表現(xiàn)出高度的可塑性和異質(zhì)性，并可誘導(dǎo)分化為2種不同的極化狀態(tài)：典型激活型（M1型）和交替激活型（M2型）[2]。M1巨噬細(xì)胞通過分泌各種細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6和IL-12發(fā)揮促炎作用；相反，M2型巨噬細(xì)胞則產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子如IL-10和IL-13[3]。調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化會(huì)影響ALI的炎癥反應(yīng)，但其機(jī)制復(fù)雜。嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophil，Eos）通常被認(rèn)為是輔助性T細(xì)胞2效應(yīng)細(xì)胞。研究顯示，用IL-4和IL-10刺激的M2型巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤[4]。脂肪組織嗜酸性粒細(xì)胞可通過IL-4和IL-13加速M(fèi)2型巨噬細(xì)胞的極化來減少炎癥反應(yīng)[5]。最近一項(xiàng)臨床評(píng)估表明嗜酸性粒細(xì)胞在ALI中具有潛在的抗炎作用[6]。為了確定嗜酸性粒細(xì)胞在ALI中的作用，本研究觀察體外嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，以及體內(nèi)注射嗜酸性粒細(xì)胞是否能改善ALI及其相關(guān)機(jī)制，旨在為ALI中嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞極化之間的相互作用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

Balb/c雄性小鼠（6周齡，體質(zhì)量22～25 g）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（SCXK（京）2016-0011）。將小鼠飼養(yǎng)在聚碳酸酯籠中，每籠5只，在無病原體和溫度控制（25℃）的環(huán)境中進(jìn)行嚴(yán)格的12 h光照/黑暗循環(huán)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和水。

1.2 嗜酸性粒細(xì)胞的體外分離和擴(kuò)增

參照文獻(xiàn)[7]方法，從骨髓中分離并擴(kuò)增嗜酸性粒細(xì)胞。取BALB/c小鼠股骨和脛骨，然后用10 mL的RPMI1640培養(yǎng)基沖洗以收集骨髓細(xì)胞。裂解紅細(xì)胞后，骨髓細(xì)胞在含有100 ng/mL FLT3配體（以色列ProSpec公司）和100 ng/mL小鼠干細(xì)胞因子（以色列ProSpec公司）的改良RPMI1640培養(yǎng)基中重新懸浮。第4天，加入10 ng/mL重組小鼠IL-5（美國BioVision公司），每隔2 d用新鮮培養(yǎng)基替換一半培養(yǎng)基。第10天采集細(xì)胞，通過FAS-Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD Biosciences公司）鑒定嗜酸性粒細(xì)胞。

1.3 巨噬細(xì)胞與嗜酸性粒細(xì)胞共培養(yǎng)

小鼠腹腔注射3%無菌硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（美國Thermo Fisher Scientific公司），3 d后頸椎脫臼法處死小鼠。在無菌條件下打開腹腔，并用15 mL預(yù)冷的無血清RMPI1640沖洗。通過離心收集腹膜灌洗液中的細(xì)胞，并將其重懸在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素（美國Gibco公司）的DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司）中。將細(xì)胞以1×106/孔的密度接種在12孔板中，并在37℃下孵育2 h，去除非貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞融合率達(dá)到80%時(shí)，以1×106/mL的密度接種在48孔板中，用5 μg/mL LPS和100 U/mL重組小鼠γ干擾素（interferon γ，IFN-γ）（美國Bio-Basic公司）刺激3 h，然后與不同比例的嗜酸性粒細(xì)胞（1∶5、1∶10、1∶20）共培養(yǎng)24 h，測(cè)定巨噬細(xì)胞極化。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)促炎及抗炎因子的mRNA表達(dá)

用RNA分離試劑盒（美國Invitrogen公司）提取肺組織或細(xì)胞總RNA，用cDNA合成試劑盒（日本TaKaRa公司）在37℃下反轉(zhuǎn)錄15 min。然后，使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa公司）和ABI 7500 PCR系統(tǒng)（美國Life Technologies公司）確定靶基因的表達(dá)水平。管家基因GAPDH用作內(nèi)部對(duì)照。IL-6基因：正向序列 為5'-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3'，反向序列為5'- TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3'；TNF-α基因：正向序列為5'-AAGCCTGTAGCCCA CGTCGTA-3'，反向序列為5'-GGCACCACTAGT TGGTTGTCTTTG-3'；IL-10基因：正向序列為5'-G CTCTTACTGACTGGCATGAG-3'，反向序列為5'-C GCAGCTCTAGGAGCATGTG-3'；重組人精氨酸酶1、（recombinant arginase 1，Arg1）基因：正向序列為5'-CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG-3'，反向序列為5'-GGAGCTGTCATTAGGGACATCA-3'；iNOS基因：正向序列為5'-CACCAAGCTGAACTTGAGC GA-3'，反向序列為5'-CCATAGGAAAAGACTGCA CCGA-3'；β-actin基因：正向序列為5'-AGTGTGA CGTTGACATCCGT-3'，反向序列為5'-GCAGCT CAGTAACAGTCCGC-3'。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)值。

1.5 免疫印跡檢測(cè)巨噬細(xì)胞中過氧化物酶增殖物激活受體γ（peroxidase proliferator-activated receptor γ，PPARγ）蛋白的表達(dá)

用冰冷的RIPA裂解緩沖液提取來自肺勻漿和細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，并使用BCA試劑盒（美國Thermo Fisher公司）測(cè)定蛋白質(zhì)含量。通過凝膠電泳將蛋白帶轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（美國Millipore公司）上，并在4℃下用5%脫脂乳封閉過夜。然后將膜與稀釋的抗PPARγ（1∶500，美國Santa Cruz Biotechnology公司）和抗β-actin抗體（1∶10 000，上?？党缮锕こ逃邢薰荆┰谑覝叵路胖? h，然后再加入HRP偶聯(lián)的二抗 （1∶2 000，美國Santa Cruz Biotechnology公司），室溫下放置40 min。使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

1.6 siRNA轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞

在24孔板中培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí)，用含干擾對(duì)照RNA（si-NC）或PPARγ siRNA（si-PPARγ）（上海GenePharma公司）轉(zhuǎn)染24 h后，再用5 μg/mL 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和100 U/mL重組小鼠IFN-γ刺激3 h，然后與嗜酸性粒細(xì)胞（1∶20）共培養(yǎng)24 h，測(cè)定巨噬細(xì)胞極化。

1.7 動(dòng)物分組和給藥治療

將60只Balb/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、ALI組和ALI+Eos組，每組20只。參照文獻(xiàn)[8]方法，ALI組通過氣管內(nèi)注射10 mg/kg LPS誘導(dǎo)ALI；對(duì)照組尾靜脈給予相同體積的PBS緩沖液；ALI+Eos組給予尾靜脈注射1×107個(gè)嗜酸性粒細(xì)胞，監(jiān)測(cè)動(dòng)物7 d的存活情況。在LPS注射后3 h和24 h處死動(dòng)物，H-E染色評(píng)估左肺損傷程度，收集右肺檢測(cè)促炎和抗炎細(xì)胞因子mRNA水平。

1.8 肺組織病理學(xué)觀察

將石蠟包埋的肺組織切成5 μm的厚度，用H-E染色，中性樹脂封固，并在BX41顯微鏡（日本Olympus公司）下評(píng)估肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。評(píng)分內(nèi)容包括間質(zhì)水腫、肺泡水腫、中性粒細(xì)胞浸潤和肺泡充血。根據(jù)嚴(yán)重程度，評(píng)分范圍為0～4分：0分為無病變或非常輕微；1分為輕度病變；2分為中度病變；3分為重度病變；4分為極重度病變。以4項(xiàng)指標(biāo)的總分平均值作為肺損傷評(píng)分。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞中iNOS和CD206的百分比

Acutase（南京福麥斯生物技術(shù)有限公司）消化肺泡巨噬細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，再懸浮在染色緩沖液（美國BD Biosciences公司）中。隨后，加入FcR阻斷試劑（美國Miltenyi公司）以提高抗體的特異性。細(xì)胞首先用表面標(biāo)記物（F4/80）染色，用固定/滲透緩沖液（南京福麥斯生物技術(shù)有限公司）固定和滲透，然后用APC偶聯(lián)的iNOS（M1型標(biāo)志物）和PE偶聯(lián)的CD206（M2型標(biāo)志物）（美國Biolegend公司）染色，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用±s表示，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，組間使用Bonferroni事后檢驗(yàn)進(jìn)行成對(duì)比較。計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)分析不同組的存活率。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響

與嗜酸性粒細(xì)胞共培養(yǎng)后，用LPS+IFN-γ刺激巨噬細(xì)胞，其TNF-α和IL-6 mRNA水平呈劑量依賴性降低，而IL-10 mRNA水平呈劑量依賴性增加（圖1A）。巨噬細(xì)胞與嗜酸性粒細(xì)胞共培養(yǎng)后，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因iNOS表達(dá)增加，M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因Arg1表達(dá)減少，且呈劑量依賴性逆轉(zhuǎn)（圖1B），提示嗜酸性粒細(xì)胞促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型分化。

圖1 嗜酸性粒細(xì)胞體外對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響

2.2 PPARγ通路參與嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化

免疫印跡檢測(cè)顯示，嗜酸性粒細(xì)胞增加巨噬細(xì)胞中的PPARγ活性（圖2A），呈劑量依賴性；且嗜酸性粒細(xì)胞顯著增加了LPS+IFN-γ刺激下PPARγ的活性（圖2B）。轉(zhuǎn)染si-PPARγ抑制了嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞向M2表型分化的促進(jìn)作用 （圖2C）。

圖2 PPARγ通路參與嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化

2.3 嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)LPS致炎性小鼠ALI的影響

7 d存活率監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，靜脈注射嗜酸性粒細(xì)胞顯著提高了ALI小鼠的存活率（P<0.01）（圖3A）。注射LPS后3 h和24 h，H-E染色顯示小鼠氣管內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重的肺水腫和炎癥浸潤，隨著時(shí)間推移組織學(xué)評(píng)分明顯增加。嗜酸性粒細(xì)胞干預(yù)可顯著改善小鼠的肺損傷，減少組織損傷（圖3B、3C）。

圖3 嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠的死亡率和肺損傷的影響

2.4 嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)ALI小鼠肺巨噬細(xì)胞極化的影響

在3 h和24 h，LPS增加了肺部促炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α mRNA水平。嗜酸性粒細(xì)胞干預(yù)可逆轉(zhuǎn)上述作用。此外，LPS也增加了肺組織中抗炎細(xì)胞因子IL-10 mRNA水平，嗜酸性粒細(xì)胞干預(yù)則進(jìn)一步增加了IL-10 mRNA的水平（圖4A）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，LPS增加了肺泡M1型巨噬細(xì)胞iNOS的百分比和M2巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因CD206的百分比，嗜酸性粒細(xì)胞干預(yù)則進(jìn)一步增加了肺泡CD206的百分比，而iNOS的百分比明顯降低（圖4B、4C）。此外，免疫印跡分析顯示，ALI+Eos組肺組織中的PPAR γ活性顯著高于ALI組（P<0.01）（圖4D）。

圖4 嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)急性肺損傷小鼠肺巨噬細(xì)胞極化的影響

3 討論

ALI與高死亡率有關(guān)，尤其是在老年患者中，它涉及由激活的細(xì)胞和體液免疫誘導(dǎo)的不受控制的系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子的積累導(dǎo)致毛細(xì)血管內(nèi)皮和肺泡上皮屏障的破壞，并導(dǎo)致隨后的肺水腫和缺氧[9]。盡管ALI的危險(xiǎn)因素多種多樣，但抑制肺部炎癥是這一危重綜合征的常見治療策略[10]。調(diào)節(jié)驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞極化的轉(zhuǎn)錄子的活性可能有助于減輕ALI患者的炎癥和改善預(yù)后，因?yàn)镸1和M2型巨噬細(xì)胞之間的平衡影響固有免疫反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間和大小，從而影響抗病原體反應(yīng)和組織損傷[11]。近年來，大量研究表明嗜酸性粒細(xì)胞在非過敏性疾病組織中蓄積，并參與腫瘤的發(fā)生[12]、腸道炎癥疾病[13]和造血干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[14]。本研究體外實(shí)驗(yàn)表明，嗜酸性粒細(xì)胞可能通過促進(jìn)PPAR-γ的表達(dá)，使巨噬細(xì)胞從M1型向M2型極化轉(zhuǎn)變，增強(qiáng)抗炎遞質(zhì)的表達(dá)，從而為調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化治療ALI提供一種潛在策略。

嗜酸性粒細(xì)胞通常認(rèn)為是寄生蟲感染或過敏性炎癥的終端效應(yīng)細(xì)胞，但越來越多的證據(jù)表明其在各種免疫反應(yīng)中具有調(diào)節(jié)作用[15]。據(jù)報(bào)道，嗜酸性粒細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞相互作用，協(xié)同促進(jìn)過敏性氣道的輔助性T細(xì)胞2免疫反應(yīng)[16]。值得注意的是，最近的一項(xiàng)臨床研究表明，ALI患者的肺中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量增加，表明嗜酸性粒細(xì)胞可能在ALI中起著保護(hù)作用[6]。此外，嗜酸性粒細(xì)胞也參與促進(jìn)損傷后組織修復(fù)的過程[17]。相反，嗜酸性粒細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的疾病患者，如哮喘，有較高的感染風(fēng)險(xiǎn)[18]。因此，嗜酸性粒細(xì)胞在ALI發(fā)病機(jī)制中的最終作用及其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究采用在氣管內(nèi)注射LPS誘導(dǎo)ALI小鼠模型，研究結(jié)果顯示靜脈注射嗜酸性粒細(xì)胞可以保護(hù)小鼠免受LPS誘導(dǎo)的死亡。ALI組大部分死亡的小鼠均處于ALI的早期階段，這可能是由于LPS激活TLR4信號(hào)通路產(chǎn)生大量炎癥遞質(zhì)，導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥浸潤促進(jìn)肺組織損傷。通過mRNA分析證實(shí)，單次LPS誘導(dǎo)后24 h內(nèi)，各種炎癥因子的水平發(fā)生變化，表明動(dòng)物處于急性炎癥的早期“細(xì)胞因子風(fēng)暴”階段。嗜酸性粒細(xì)胞下調(diào)了肺部的促炎基因（TNF-α和IL-6）表達(dá)，上調(diào)了抗炎基因（IL-10）表達(dá)，提示嗜酸性粒細(xì)胞抑制了LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥。進(jìn)一步流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，給予嗜酸性粒細(xì)胞顯著提高了ALI小鼠肺中M2型巨噬細(xì)胞的百分比。提示嗜酸性粒細(xì)胞可以通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1型轉(zhuǎn)化為M2抗炎表型來減輕LPS誘導(dǎo)的ALI。

PPARγ在炎癥調(diào)節(jié)和膿毒癥進(jìn)展中扮演著重要角色[19]。有研究表明，活化PPARγ可顯著降低膿毒癥炎癥遞質(zhì)的表達(dá)和組織損傷[20]。也有研究表明，激活PPARγ可顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型極化，從而抑制炎癥反應(yīng)[21]。因此，PPARγ可能有助于嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)其對(duì)早期ALI的保護(hù)作用。在本研究的體外實(shí)驗(yàn)中，嗜酸性粒細(xì)胞顯著增加了LPS+IFN-γ刺激下PPARγ的活性，并且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示嗜酸性粒細(xì)胞增強(qiáng)了ALI大鼠肺組織中PPARγ的活性。因此，嗜酸性粒細(xì)胞促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2極化可能與PPARγ高表達(dá)相關(guān)，而PPARγ可直接作用于NF-κB以逆轉(zhuǎn)M1/M2極化[21]。

綜上所述，本研究揭示了嗜酸性粒細(xì)胞通過激活PPARγ信號(hào)通路，顯著增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞M2極化，并改善了LPS誘導(dǎo)的ALI。這些研究結(jié)果可能為ALI的診斷和干預(yù)提供新的方法。