張珊珊 苗 豐 劉 露 呂文瑤 張 紳 趙志峰

1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧沈陽 110032；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腫瘤科，遼寧沈陽 110032

細(xì)胞毒素相關(guān)基因A（cytotoxin related gene A，CagA），是幽門螺桿菌（Helicobacter pylor，Hp）的重要毒力因素之一，是Hp-CagA 致病島編碼的蛋白質(zhì)。研究顯示，與CagA 陰性菌株比較，CagA 陽性菌株Hp感染胃癌風(fēng)險明顯增加[1-4]。CagA 與腸化生發(fā)生關(guān)系密切，CagA 與E-cadherin 和β-catenin 信號通路相互作用可能是導(dǎo)致腸化生的重要因素，但CagA 促使胃上皮向腸樣上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機制尚未完全闡明[5-6]。尾型同源盒基因1（cadual type homeobox transcription factor 1，CDX1）是一種同源盒轉(zhuǎn)錄因子，是一種βcatenin 依賴性基因，由解除調(diào)控的β-catenin 反式激活，可由Hp-CagA 觸發(fā)，在人類腸道發(fā)育和功能維持中發(fā)揮重要作用[7-8]。對恒河猴的研究顯示，Hp 感染胃黏膜后，胃上皮細(xì)胞CDX1 表達(dá)增加1.59 倍，異常表達(dá)的CDX1 與Barrett 食管發(fā)育及腸化生、異型增生和胃癌發(fā)生密切相關(guān)[9]。既往研究顯示，穩(wěn)定表達(dá)CagA 的胃癌細(xì)胞中CDX1 表達(dá)增加[10]。本研究觀察Hp 毒力因子CagA 是否增加人正常胃上皮HFE145細(xì)胞中CDX1 表達(dá)及CDX1 對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響，評估CDX1作為胃癌化學(xué)預(yù)防和潛在靶點的可行性?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下：

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和試劑

人正常胃上皮細(xì)胞HFE145 細(xì)胞系（武漢普諾賽生命科技有限公司）；Hp 野生型60190 菌株和CagA敲除60190ΔA 菌株（青旗上海生物技術(shù)發(fā)展有限公司）；CagA 陽性質(zhì)粒WT-CagA 和陰性質(zhì)粒pcDNA3.1（韓國延世大學(xué)李勇教授提供）；慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)人CDX1 shRNA（SC-35731-V，大連寶生物工程有限公司）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000（賽默飛世爾，919437）；嘌呤霉素（MedChemExpress LLC，純度99.87%，419E0418）；E-cadherin、Vimentin、N-cadherin 一抗（圣克魯斯生物技術(shù)，A-AJ1249a、WL00742A、LO-ANR-082-50）；RIPA Lysis and Extraction Buffer、BCM 蛋白定量試劑盒、ECL 發(fā)光檢測試劑盒（碧云天生物科技有限公司，89900、P1511-1、36223ES60）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HFE145 細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔天換液，細(xì)胞生長至70%～80%的致密度時用0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳至3～4 代后進(jìn)行實驗。

1.3 CagA 對HFE145 細(xì)胞影響

將細(xì)胞調(diào)整于5×105細(xì)胞/孔接種于6 孔版，37℃培養(yǎng)20 h，無菌PBS 洗滌1 次，以100∶1 的感染倍數(shù)添加60190 菌株和60190ΔA 菌株分別為60190 組、60190ΔA 組，空白組不加細(xì)菌，僅加培養(yǎng)基。24 h 后采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞分為對照組、陰性組、CagA 組和聯(lián)合組，分別采用Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染空白試劑、pcDNA3.1、WT-CagA、WT-CagA 聯(lián)合SC-35731-V，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.5 Transwell 小室法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移及侵襲能力

按“1.4”項下方法轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞以5×103細(xì)胞/孔均勻接種于鋪有基質(zhì)膠的Transwell 小室底部，再將小室置于10%FBS 培養(yǎng)基的孔板中培養(yǎng)，24 h 后取出小室，清洗后采用多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，鏡檢計數(shù)。細(xì)胞遷移實驗除不使用基質(zhì)膠外其余步驟與侵襲實驗相同。

1.6 Western blot 法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中CDX1、CagA、E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)水平

Wester blot 法檢測轉(zhuǎn)染后四組CDX1、CagA、E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 蛋白表達(dá)水平，以GAPDH 為內(nèi)參。

1.7 熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

采用引物正向：5’-CTCGAGGATCCCGATTCACAAAC-3’和反向：5’-AAGCTTCAACCCATCCAACC-3’擴增CDX1 啟動子片段，然后用PCR 技術(shù)克隆到pGL3堿性熒光素酶載體中。為了測定CDX1 啟動子中CagA 的結(jié)合位點，將CDX1 啟動子的1000 bp 片段分為Mut 500 和Mut 1000，并進(jìn)行了相同的克隆實驗（Mut 500 引物，正向：5’-CTCGAGACTCCAGCTTCCATGA-3’和反向：5’-AAGCTTCACCCTGACTC-3；Mut 1000 引物，正向：5’-CTCGAGGGATTCCGATTCACAAAC-3’和反向：5’-AAGCTTTCCCTGGAATGCACAAAC-3’）。將WT-CagA 克隆到HA 標(biāo)記的pSP36SR 載體中。HFE145 細(xì)胞細(xì)胞以6×105細(xì)胞/孔的密度接種于6 孔板中。用LT1（Mirus Bio LLC）與1.3 μg CagA cDNA psP65SR 載體、1 μg CDX1 啟動子熒光素酶質(zhì)粒和20 ng pNL1.1 質(zhì)粒（Promega 公司）共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。2 d 后，收集細(xì)胞，裂解，并使用Nano-Glo 雙熒光素酶報告系統(tǒng)（Promega 公司）分析熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 法，兩組間比較采用t 檢驗。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CagA 對HFE145 細(xì)胞生長的影響

空白組和690190ΔA 組HFE145 細(xì)胞呈多形或樹形，細(xì)胞輪廓清晰，胞核、胞漿分界清楚；60190 組HFE145 細(xì)胞拉長，呈現(xiàn)典型“蜂鳥表型”。見圖1。

圖1 CagA 對HFE145 細(xì)胞生長的影響（200×）

2.2 CagA 轉(zhuǎn)染對HFE145 細(xì)胞CagA 和CDX1 蛋白表達(dá)的影響

對照組和陰性組未見CagA 表達(dá)，CagA 組和聯(lián)合組CagA 蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。CagA 組CDX1 蛋白表達(dá)水平高于對照組和陰性組（P ＜0.05）；聯(lián)合組CDX1 蛋白表達(dá)水平低于CagA 組（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 CagA 轉(zhuǎn)染對HFE145 細(xì)胞CagA 和CDX1 蛋白表達(dá)的影響

2.3 CagA 對HFE145 細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

CagA 組HFE145 細(xì)胞侵襲及遷移能力高于對照組和陰性組（P ＜0.05），聯(lián)合組HFE145 細(xì)胞侵襲及遷移能力低于CagA 組（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 CagA 對HFE145 細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

2.4 熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果

缺失CDX1 外顯子上游501～1000 堿基對不抑制熒光素酶活性，缺失1～500 堿基對抑制熒光素酶活性。見圖4。

圖4 熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果

2.5 CagA 轉(zhuǎn)染對EMT 相關(guān)蛋白的影響

CagA 組E-cadherin 蛋白表達(dá)水平低于對照組和陰性組（P ＜0.05），聯(lián)合組E-cadherin 蛋白表達(dá)水平高于CagA 組（P ＜0.05）。CagA 組Vimenti 和N-cadherin 水平高于對照組和陰性組（P ＜0.05），聯(lián)合組Vimenti 和N-cadherin 水平低于CagA 組（P ＜0.05）。見圖5。

圖5 CagA 轉(zhuǎn)染對EMT 相關(guān)蛋白的影響

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，胃癌的發(fā)生包括彌漫性慢性胃炎、黏膜萎縮、腸化生、上皮內(nèi)瘤變、浸潤性胃癌等過程，Hp 感染促進(jìn)腸化生的發(fā)展，作為胃癌前病變，腸化生已被廣泛研究，但其形成和發(fā)展尚未完全闡明[11-13]。本研究結(jié)果顯示，Hp 分泌的毒力因子CagA 可促進(jìn)CDX1 的異常表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞侵襲或遷移，誘導(dǎo)EMT 轉(zhuǎn)化。既往研究顯示，CDX1 是癌前病變向腫瘤性病變轉(zhuǎn)換的重要機制，CDX1 基因敲除可逆轉(zhuǎn)癌前病變的轉(zhuǎn)化[14]。本研究及前期研究均顯示其可誘導(dǎo)EMT 分化和癌前病變。

既往研究[15]顯示，Hp 感染可誘導(dǎo)CDX1 表達(dá)，導(dǎo)致慢性炎癥，隨后胃上皮細(xì)胞凋亡增加，導(dǎo)致萎縮、分化狀態(tài)改變、化生和表達(dá)腸標(biāo)志物的腸細(xì)胞樣細(xì)胞出現(xiàn)。CDX1 上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子，如SALL4、KLF5（27）和PPARγ，促進(jìn)胃上皮細(xì)胞向腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化[16]。對668 例胃癌患者的臨床研究顯示，PPARγ 表達(dá)可預(yù)測腸型胃癌患者的預(yù)后，但對彌漫型胃癌的預(yù)后無預(yù)測作用[17]。由于CDX1 在顯示腸化生的胃和食管組織中的表達(dá)水平高于正常水平[18]，本研究揭示的功能可能有助于理解萎縮性胃炎和腸化生。

缺失CDX1 外顯子上游501～1000 堿基對不抑制熒光素酶活性，缺失1～500 堿基對抑制熒光素酶活性，提示CagA 相關(guān)因子的潛在結(jié)合位點位于指定區(qū)域，在CDX1 外顯子上游保留1～500 個堿基對的截短突變下，熒光素酶活性增加可能是由于啟動子面積縮短而增加了結(jié)合親和力，證實CagA 依賴性CDX1 的表達(dá)，并確定CagA 相關(guān)因子的潛在結(jié)合位點。CDX1 沉默部分逆轉(zhuǎn)了CagA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的侵襲表型，降低了EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)，恢復(fù)了正常上皮標(biāo)志物的表達(dá)，這一結(jié)果支持了腸化生至少可以部分逆轉(zhuǎn)的觀點。盡管最近的研究發(fā)現(xiàn)根除Hp 可部分逆轉(zhuǎn)癌前病變，但根除Hp 后腸上皮化生的可逆性仍存在爭議[19-22]。抗糖尿病藥物二甲雙胍在體外和體內(nèi)的作用與CDX1抑制相似：逆轉(zhuǎn)腫瘤干細(xì)胞樣表型，抑制腫瘤發(fā)生和腫瘤生長，提高對某些化療藥物的敏感性。研究顯示，二甲雙胍抑制腫瘤生長的途徑包括：抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、激活A(yù)MPK（40）抑制mTOR 途徑以及抑制胰島素分泌和IGF-1 信號傳導(dǎo)，CDX1 可能是二甲雙胍的另一個靶點，具有腫瘤啟動潛能的癌細(xì)胞群對其能量產(chǎn)生的反應(yīng)更多地是氧化磷酸化而不是糖酵解，二甲雙胍是一種有效的氧化磷酸化抑制劑，它有可能抑制了這些氧化磷酸化依賴性癌干細(xì)胞的活性，而這恰好是CDX1 表達(dá)細(xì)胞的一個主要特征[23-24]。動物研究[25]顯示，二甲雙胍治療異種移植小鼠后CDX1 表達(dá)減少。提示使用可能抑制與CDX1 表達(dá)相關(guān)的表型變化的藥物，例如在發(fā)生萎縮或腸化生后使用二甲雙胍可能對預(yù)防病情進(jìn)展有利。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)Hp 毒力因子CagA 誘導(dǎo)的CDX1的異常表達(dá)促進(jìn)胃上皮EMT，靶向性抑制CDX1 在逆轉(zhuǎn)EMT 發(fā)生發(fā)展和胃癌防治的作用具有進(jìn)一步研究的價值。