鄭安娜，趙夢瑤，游江珊，潘小旭，趙黎明

（華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心，生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

2 型糖尿病是一類糖代謝性紊亂的慢性疾病，以高血糖為主要特征，伴隨靶組織的胰島素抵抗和胰島細(xì)胞的胰島素分泌相對(duì)不足[1?2]。胰島素抵抗是指機(jī)體對(duì)胰島素敏感度降低而無法降低血糖，胰島β細(xì)胞為了克服血糖的升高會(huì)分泌更多的胰島素從而長期處于超負(fù)荷狀態(tài)，最終造成胰島功能損傷[3?4]。胰島素抵抗伴隨代謝紊亂，產(chǎn)生機(jī)制極其復(fù)雜，受遺傳和環(huán)境等多重因素相互影響[5]。從細(xì)胞水平上看，胰島素抵抗的發(fā)生主要由于胰島素作用的靶器官細(xì)胞產(chǎn)生缺陷，不能正常利用葡萄糖，從而引起血糖水平升高。從分子水平上看，引起胰島素抵抗產(chǎn)生的原因主要可分為胰島素受體前缺陷、受體缺陷以及受體后缺陷[6]。

殼寡糖是一種潛在的食品營養(yǎng)品[7]，具有許多優(yōu)良的生物活性，在食品、醫(yī)藥等行業(yè)廣泛應(yīng)用。殼寡糖能有效降低血糖，改善胰島素抵抗，對(duì)糖尿病有一定的干預(yù)作用且具有安全性高、作用溫和持久等特點(diǎn)[8?11]，在降血糖功能食品的開發(fā)中具有重要價(jià)值。二甲雙胍是治療2 型糖尿病的典型藥物[12?13]，但其會(huì)引起乳酸中毒等不良副反應(yīng)[14]。殼寡糖胍鹽酸鹽是指在殼寡糖的氨基上引入二甲雙胍的特征結(jié)構(gòu)胍基形成一種糖基胍化合物[15]，其對(duì)糖尿病具有潛在的改善作用，有望成為一種新型的功能性食品。早在1989 年，Reitz 等[16]合成的含雙胍官能團(tuán)的單糖具有良好的降血糖的活性，近年來也有部分研究表明殼聚糖胍鹽酸鹽和殼寡糖胍鹽酸鹽均能有效降低血糖[17?18]。Zhang 等[17]發(fā)現(xiàn)殼聚糖雙胍鹽酸鹽能夠顯著提高胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗量，有效改善HepG2 細(xì)胞的胰島素抵抗情況。王園園等[19]發(fā)現(xiàn)殼寡糖胍鹽酸鹽可改善2 型糖尿病大鼠胰島素抵抗，調(diào)節(jié)骨骼肌中胰島素抵抗相關(guān)蛋白的表達(dá)，具有良好的應(yīng)用前景。Wang 等[20]發(fā)現(xiàn)殼寡糖胍鹽酸鹽能夠降低L6 骨骼肌細(xì)胞中的胰島素抵抗，顯著提高L6 細(xì)胞的活力以及促進(jìn)葡萄糖的吸收。但由于上述研究基本上是基于殼聚糖或殼寡糖混合物的胍基取代物，尚未有單一聚合度特定結(jié)構(gòu)的糖基胍化合物的降糖效果評(píng)價(jià)和干預(yù)機(jī)理研究，阻礙了該類糖基衍生物的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用。

本研究以殼三糖胍鹽酸鹽這一單一聚合度殼寡糖衍生物為對(duì)象，初步評(píng)價(jià)了單一聚合度殼寡糖胍鹽酸鹽在胰島素抵抗細(xì)胞模型中的改善作用，為開發(fā)新型并具有糖尿病輔助干預(yù)效果的食品營養(yǎng)品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2 上海中國科學(xué)院提供；殼三糖 實(shí)驗(yàn)室自制，結(jié)構(gòu)式見圖1（A），純度為99.4%、脫乙酰度為100%；殼三糖胍鹽酸鹽 實(shí)驗(yàn)室自制，結(jié)構(gòu)式見圖1（B），胍基取代度按照元素分析法進(jìn)行測定[21]，測得實(shí)際樣品中三種取代度分別為54%、67%、78%；棕櫚酸、葡萄糖、二甲基亞砜、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT） 上海泰坦科技股份有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、雙抗、胰酶 天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；胎牛血清 美國Gibco 公司；葡萄糖測試盒、糖原測試盒、一氧化氮合成酶（NOS）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

圖1 殼三糖和殼三糖胍鹽酸鹽結(jié)構(gòu)Fig.1 Structural formulas of chitotriose and chitotriose guanidine hydrochloride

Synergy HF 酶標(biāo)儀 美國Bio Tek 公司；1379型生物安全柜 美國Thermo Fisher Scientific 公司；H1850R 高速低溫離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DXS-1 倒置生物顯微鏡 上海締綸有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HepG2 細(xì)胞復(fù)蘇后，使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基并于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至80%以上且生長狀態(tài)良好時(shí)，使用0.25%的胰酶消化傳代，并取一定量細(xì)胞計(jì)數(shù)、鋪板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立及驗(yàn)證 以葡萄糖（糖）濃度為25、40、60、80、100 mmol/L（不含脂）和棕櫚酸（脂）濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mmol/L（固定糖濃度為25 mmol/L）的培養(yǎng)基分別誘導(dǎo)細(xì)胞24 h，采用MTT 比色法測定細(xì)胞活力以篩選出安全劑量，接著使用安全劑量的葡萄糖和棕櫚酸誘導(dǎo)細(xì)胞24 h后測定葡萄糖吸收量以確定建模的最佳誘導(dǎo)濃度，最后使用篩選出的葡萄糖和棕櫚酸的濃度誘導(dǎo)細(xì)胞24、48、72 h 后，測定葡萄糖吸收量確定建模的最佳誘導(dǎo)時(shí)長[22]。在成功建立模型后，分別測定正常組與模型組的葡萄糖吸收量和糖原含量比較其差異以驗(yàn)證胰島素抵抗細(xì)胞模型是否成功建立。

1.2.3 殼三糖胍鹽酸鹽胍基取代度的篩選 按照

1.2.2 篩選的最佳建模方法進(jìn)行建模后，設(shè)置正常組、模型組、處理組，其中正常組為正常HepG2 細(xì)胞且不加樣處理，模型組為胰島素抵抗模型細(xì)胞不加樣處理，處理組使用濃度為600 μg/mL，胍基取代度分別為54%、67%、78%的殼三糖胍鹽酸鹽對(duì)模型細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)24 h，測定各組細(xì)胞活力和葡萄糖吸收量。

1.2.4 殼三糖胍鹽酸鹽濃度的篩選 按照1.2.2 篩選的最佳建模方法進(jìn)行建模后，設(shè)置正常組、模型組、處理組，其中處理組使用胍基取代度為78%，濃度分別50、300、600、900、1200 μg/mL的殼三糖胍鹽酸鹽對(duì)模型細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)24 h，測定各組細(xì)胞活力以篩選出安全劑量，接著使用安全劑量的殼三糖胍鹽酸鹽干預(yù)模型細(xì)胞24 h，測定各組葡萄糖吸收量。

1.2.5 殼三糖胍鹽酸鹽對(duì)胰島素抵抗的改善作用按照1.2.2 篩選的最佳建模方法進(jìn)行建模后，設(shè)置正常組、模型組、處理組，其中處理組分別為殼三糖組（600 μg/mL）、殼三糖胍鹽酸鹽組（600 μg/mL、胍基取代度為78%）、二甲雙胍組（600 μg/mL）對(duì)模型細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)24 h，測定各組的葡萄糖吸收量、糖原含量、細(xì)胞iNOS 活力。

1.2.6 細(xì)胞活力的測定 采用MTT 法測定細(xì)胞活力，可以此來評(píng)定樣品細(xì)胞毒性大小。在避光條件下，向待測細(xì)胞活力的樣本中加入10 μL MTT 溶液后于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，肉眼可觀察到產(chǎn)生藍(lán)紫色沉淀。移除上清液，每組加入100 μL 二甲基亞砜溶解沉淀，待完全溶解后使用酶標(biāo)儀于570 nm 波長下測定其吸光值。細(xì)胞活力比計(jì)算見式（1）和式（2）。

1.2.7 葡萄糖含量的測定 葡萄糖的準(zhǔn)確測定是診斷糖尿病的依據(jù)之一，本研究采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法進(jìn)行測定[23?24]。取待測樣品1 μL 上清培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)校準(zhǔn)組和空白組，各組均加入100 μL 葡萄糖試劑，37 ℃孵育10 min 后于505 nm處測定各組吸光值，并且測定每組的蛋白含量平衡細(xì)胞量差異。葡萄糖吸收量比計(jì)算見式（3）和（4）。

式（3）中：5.55 表示校準(zhǔn)品濃度，mmol/L；25 表示 DMEM 培養(yǎng)基的糖濃度，mmol/L。

1.2.8 糖原含量的測定 糖原在濃硫酸的催化下和蒽酮反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)色化合物，其含量可與同法處理的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液比色確定。將待測糖原樣品加一定量堿液沸水浴20 min 后取100 μL 樣品作為實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)組和空白組。各組均加入顯色液2 mL 并沸水浴5 min，待其冷卻后于620 nm 處測定OD 值，并且測定每組的蛋白含量平衡細(xì)胞量之間的差異。細(xì)胞糖原含量比計(jì)算見式（5）和式（6）。

式（5）中：0.01 表示標(biāo)準(zhǔn)品濃度，mg/mL；10 為稀釋倍數(shù)；1.11 為葡萄糖含量換算。

1.2.9 細(xì)胞一氧化氮（iNOS）活力的測定 分子氧在NOS 催化下產(chǎn)生NO，而NO 與親核性物質(zhì)形成于530 nm 處有高OD 值的物質(zhì)。因此可依據(jù)OD 值測定細(xì)胞NOS 活力。取10 μL 待測細(xì)胞iNOS 活力的樣品按照NOS 測定試劑盒說明書進(jìn)行操作加樣、混勻。使用酶標(biāo)儀于530 nm 處測定各組OD 值，并且測定每組的蛋白含量平衡細(xì)胞量之間的差異，細(xì)胞iNOS 活力計(jì)算見式（7）和式（8）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，設(shè)置5 組平行實(shí)驗(yàn)，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，單因素方差分析法（One-way AVONA）分析比較，Graphpad Prism 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立及驗(yàn)證

采用高糖高脂誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞建立胰島抵抗細(xì)胞模型，建模結(jié)果如圖2 所示，隨著葡萄糖濃度增加，細(xì)胞活力下降不明顯（圖2A），但隨著棕櫚酸濃度增加，細(xì)胞活力持續(xù)降低，說明高濃度的棕櫚酸會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷。當(dāng)棕櫚酸濃度大于0.5 mmol/L 時(shí)細(xì)胞存活率極低，細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷（圖2B）。因此，選用安全劑量的葡萄糖濃度為25、40、60、80、100 mmol/L，棕櫚酸濃度為0.05、0.1、0.2 mmol/L 處理HepG2 細(xì)胞一定時(shí)間后監(jiān)測其葡萄糖吸收量，以確定建模的最佳誘導(dǎo)濃度及時(shí)間。如圖2（C、D、E）所示，葡萄糖和棕櫚酸誘導(dǎo)后各組葡萄糖吸收量均有所下降，其中當(dāng)葡萄糖濃度為40 mmol/L，棕櫚酸濃度為0.1 mmol/L時(shí)，誘導(dǎo)24 h 后葡萄糖吸收量最小，且與正常組相比差異顯著（P<0.05）。因此，選擇該條件建立胰島素抵抗細(xì)胞模型。

圖2 胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立Fig.2 Establishment of the insulin resistance cell model

對(duì)該胰島素抵抗細(xì)胞模型進(jìn)行驗(yàn)證，如圖3 所示，和正常組相比，模型組細(xì)胞葡萄糖吸收量降低26.3%，糖原含量降低22.9%（P<0.05），表明模型組細(xì)胞受損處于糖代謝紊亂的狀態(tài)[24]，成功建立可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的胰島素抵抗細(xì)胞模型。

圖3 胰島素抵抗細(xì)胞模型的驗(yàn)證Fig.3 Validation of the insulin resistance cell model

2.2 殼三糖胍鹽酸鹽的胍基取代度對(duì)細(xì)胞活力、葡萄糖吸收量的影響

殼三糖是由氨基葡萄糖通過β-1,4 糖苷鍵連接而成的三糖，因此在胍基取代時(shí)取代度可能不同，而殼三糖分子上連接的胍基數(shù)量與其生理活性有相關(guān)性，故需要探究不同取代度的殼三糖胍鹽酸鹽對(duì)細(xì)胞活力和葡萄糖吸收量的影響。如圖4（A）所示，不同胍基取代度的殼三糖胍鹽酸鹽與模型組相比細(xì)胞活力沒有顯著變化(P>0.05)，說明其安全性較高，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。接著進(jìn)行葡萄糖吸收量的測定，結(jié)果如圖4（B）所示，三種胍基取代度的殼三糖胍鹽酸鹽的均能顯著提高模型細(xì)胞中的葡萄糖吸收量（P<0.05），其中胍基取代度為78%的殼三糖胍鹽酸鹽效果最佳，說明高胍基含量對(duì)葡萄糖吸收量的改善效果更佳。因此，選用胍基取代度為78%的殼三糖胍鹽酸鹽進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同胍基取代度的殼三糖胍鹽酸鹽的篩選Fig.4 Screening of chitotriose guanidine hydrochloride with different degree of substitution of guanidine group

2.3 殼三糖胍鹽酸鹽的濃度對(duì)細(xì)胞活力、葡萄糖吸收量的影響

采用MTT 法測定各組的細(xì)胞活力，對(duì)殼三糖胍鹽酸鹽的干預(yù)濃度進(jìn)行初步篩選。如圖5（A）所示，當(dāng)殼三糖胍鹽酸鹽的干預(yù)濃度分別為50、300、600 μg/mL 時(shí)，與模型組相比細(xì)胞活力均沒有下降，相反有略微提升，但無顯著性差異（P>0.05）；當(dāng)濃度大于900 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞活力顯著下降（P<0.05），因此選出干預(yù)濃度為50、300、600 μg/mL。接著比較不同干預(yù)濃度的殼三糖胍鹽酸鹽對(duì)模型細(xì)胞葡萄糖吸收量的改善效果差異（B），當(dāng)濃度為50 μg/mL 時(shí)對(duì)模型組的葡萄糖吸收量沒有顯著性影響（P>0.05），而300、600 μg/mL 能顯著提高模型細(xì)胞的葡萄糖吸收量（P<0.05），其中600 μg/mL 效果較佳。因此后續(xù)研究選用干預(yù)濃度為600 μg/mL。

圖5 不同濃度的殼三糖胍鹽酸鹽的篩選Fig.5 Screening of different concentrations of chitotriose guanidine hydrochloride

2.4 殼三糖胍鹽酸鹽對(duì)對(duì)胰島素抵抗的改善作用

2.4.1 殼三糖胍鹽酸鹽對(duì)葡萄糖吸收量的影響 對(duì)比殼三糖胍鹽酸鹽、二甲雙胍和殼三糖對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞模型中葡萄糖吸收量的影響，結(jié)果如圖6 所示。殼三糖胍鹽酸鹽組能顯著提高葡萄糖吸收量，與模型組相比提升22.8%（P<0.05）；且與殼三糖組相比，提升9.0%（P<0.05）。因此，殼三糖胍鹽酸鹽能提高受損的HepG2 細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收量，且比殼三糖效果更佳。前人合成的混合聚合度殼寡糖胍鹽酸鹽與本研究結(jié)果相似，Zhang 等[18]發(fā)現(xiàn)殼寡糖胍可通過調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUTs）的表達(dá)來控制葡萄糖的攝取，顯著降低血糖水平。Wang 等[20]合成了COSG 用于降低L6 骨骼肌細(xì)胞中的胰島素抵抗，發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收。

圖6 殼三糖胍鹽酸鹽對(duì)葡萄糖吸收量的影響Fig.6 Effect of chitotriose guanide hydrochloride on glucose absorption

2.4.2 殼三糖胍鹽酸鹽對(duì)糖原含量的影響 糖原是機(jī)體儲(chǔ)存糖的主要形式，對(duì)維持血糖的相對(duì)穩(wěn)定極為重要。當(dāng)血糖較高時(shí)，機(jī)體各組織均能利用葡萄糖合成糖原以降低血糖；當(dāng)血糖較低時(shí)，肝糖元能分解輸出葡萄糖以升高血糖。如圖7 所示，殼三糖胍鹽酸鹽組能顯著改善模型細(xì)胞的糖代謝紊亂，顯著提高糖原含量24.2%（P<0.05），且與殼三糖組相比，提升糖原含量8.4%（P<0.05）。因此，殼三糖胍鹽酸鹽能改善受損的HepG2 細(xì)胞中糖代謝紊亂，減輕高糖高脂引起的糖原含量下降，且比殼三糖作用效果更佳。

圖7 殼三糖胍鹽酸鹽對(duì)糖原含量的影響Fig.7 Effect of chitotriose guanide hydrochloride on glycogen content

2.4.3 殼三糖胍鹽酸鹽對(duì)細(xì)胞iNOS 活力的影響細(xì)胞iNOS 含量往往與炎癥相關(guān)，可以直接反應(yīng)機(jī)體的氧化應(yīng)激水平，在整個(gè)2 型糖尿病的病理發(fā)展過程中起重要作用。如圖8 所示，當(dāng)HepG2 細(xì)胞受到高糖高脂誘導(dǎo)后，細(xì)胞受損處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，iNOS活力顯著高于正常組水平（P<0.05）。殼三糖胍鹽酸鹽組能顯著降低胰島素抵抗細(xì)胞模型iNOS 活力18.4%（P<0.05），且比殼三糖效果更佳。因此，殼三糖胍鹽酸鹽能減輕胰島素抵抗細(xì)胞模型細(xì)胞的氧化應(yīng)激。有研究者發(fā)現(xiàn)殼聚糖胍鹽酸鹽（CSGH）是一種優(yōu)異的抗氧化劑，能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。Liu 等[21]發(fā)現(xiàn)CSGH 清除DPPH 自由基的能力明顯優(yōu)于殼聚糖，而且對(duì)氧化損傷的細(xì)胞具有優(yōu)異的修復(fù)作用。

圖8 殼三糖胍鹽酸鹽對(duì)細(xì)胞iNOS 活力的影響Fig.8 Effect of chitotriose guanide hydrochloride on cell iNOS activity

3 結(jié)論

利用高糖高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)了殼三糖胍鹽酸鹽對(duì)胰島素抵抗的改善作用，為開發(fā)新型功能食品提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，殼三糖胍鹽酸鹽對(duì)胰島素抵抗的HepG2 細(xì)胞模型具有干預(yù)作用，且不同濃度以及胍基取代度具有的干預(yù)效果不同。其中600 μg/mL、78%胍基取代度的殼三糖胍鹽酸鹽的干預(yù)效果最佳，能顯著提高受損HepG2 細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收量，減輕高糖高脂引起的糖原含量下降，降低細(xì)胞內(nèi)iNOS 活力，減輕氧化應(yīng)激，且干預(yù)效果明顯優(yōu)于殼三糖。因此，單一聚合度的殼三糖胍鹽酸鹽對(duì)胰島素抵抗有一定的改善作用，有望成為具有預(yù)防或輔助治療糖尿病的新型食源性功能產(chǎn)品。但因其改善的作用機(jī)制仍不清晰，如何介導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)通路仍需進(jìn)一步深入探究。