馮潔雅，張桂容，蔡 吉，劉 軍,2，溫雪瓶,2，劉雪嬌，附俊杰，李 麗,2,（.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644000；2.四川省川南曬制麩醋生物釀造技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

四川曬醋屬于我國“四大名醋”[1]之一的四川麩醋，它是以麩皮、大米為主要原料，沿用歷史傳統(tǒng)秘方的釀制技藝，經(jīng)蒸煮、發(fā)酵、日曬（其醋醅和醋液均需經(jīng)自然條件下曬制）和陳釀四大工藝流程，20 多道工序制成，故而簡稱“曬醋”。具體工藝流程見圖1。其產(chǎn)品色澤黑褐、無沉淀、香氣芬芳，具有酸味醇厚、微甜爽口、回味悠長、久存不腐的特點(diǎn)[2?3]。距今已有160 余年的生產(chǎn)歷史，經(jīng)幾代釀造技師（掌缸師）的不斷探索、挖掘、整理和傳承，該釀制技藝已獲得“省級(jí)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)”的稱號(hào)。

圖1 四川曬醋生產(chǎn)工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of Sichuan Sun vinegar production

我國歷史上的“四大名醋[4?10]”除了福建永春紅曲醋[11]采用液態(tài)發(fā)酵外，其他三種名醋均采用固態(tài)發(fā)酵的方式；四川曬醋以麩皮為主要釀制原料，固態(tài)開放式多菌種混合接種，輔以獨(dú)特的藥曲配方，采用糖化、酒化、醋化同池進(jìn)行（俗稱：三邊同池發(fā)酵）發(fā)酵，形成獨(dú)特微生物群落結(jié)構(gòu)，這是區(qū)別于其他食醋之根本所在[12]。但是當(dāng)前對(duì)曬醋發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化及其代謝機(jī)理的研究不足，不利于非物質(zhì)文化的傳承，也不利于四川曬醋的規(guī)?；a(chǎn)和產(chǎn)品創(chuàng)新，因此迫切需要對(duì)四川曬醋的發(fā)酵過程進(jìn)行探索，了解其微生物群落結(jié)構(gòu)變化及其規(guī)律。

近年來，隨著分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）代替了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和分離技術(shù)，一次對(duì)樣品中幾十萬到幾百萬條DNA 分子進(jìn)行序列測定，可快速確定其中微生物的種類和豐度[13?15]，分析速度快、結(jié)果精準(zhǔn)，因而特別適合對(duì)復(fù)雜微生物生態(tài)系統(tǒng)的區(qū)系結(jié)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)分析，在與微生物群落變化相關(guān)的所有產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景[16?18]，該技術(shù)也成為了研究微生物生態(tài)的首選方法。

綜合目前國內(nèi)對(duì)食醋的研究狀況分析[19?26]，利用高通量測序技術(shù)對(duì)四川曬醋的研究還未見報(bào)道，且尚無對(duì)四川曬醋微生物群落分析的研究，尤其是對(duì)四川曬醋的微生物群落變化、功能菌等方面的研究。因此，利用高通量測序技術(shù)研究四川曬醋微生物群落結(jié)構(gòu)變化及其規(guī)律，為了解微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，探索優(yōu)勢微生物及其代謝機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)，也為四川曬醋的改革和行業(yè)發(fā)展提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

固態(tài)發(fā)酵過程中的醋醅 取自四川某曬醋廠，取樣時(shí)間以隔天取樣計(jì)，分別為1、3、5、7、9、11、13、15、17 d，共9 個(gè)樣品(分別標(biāo)記為P1,P3，…P17)。每個(gè)樣本采用三點(diǎn)取樣，如圖2 所示，將上面的三個(gè)樣本混合均勻，取500 g 樣本用無菌塑料袋收集，低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，并于?20 ℃冰箱保存。

圖2 醋醅取樣點(diǎn)分布圖Fig.2 Distribution of sampling sites in Cupei

DNA Marker 大連Takara 公司；細(xì)菌DNA 提取試劑盒 杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司；OmegaDNA 提取試劑盒、10×PBS 緩沖液（pH7.4）北京全式金生物技術(shù)有限公司；Q5?High-Fidelity DNA Polymerase 北 京 NEB 公 司；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 賽默飛公司；TE412-L 精密電子天平 北京賽多利斯儀器公司；AT-710 電位自動(dòng)滴定計(jì) 日本精度電子制造有限公司；MT-5000 pH 計(jì) 上海三本環(huán)?？萍加邢薰?；Eppendorf N13462C 移液器 德國Eppendorf 公司；Illumina MiSeq 測序儀 美 國 Illumina 公 司；2720 型PCR 儀 ABI 公司；DYY-6C 電泳儀 北京六一儀器廠；BioTek ELx800 酶標(biāo)儀 美國Biotek;TGL 高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀儀器有限公司；Agilent 5977B 高效液相色譜儀、7890A-5975B 高效氣相色譜質(zhì)譜儀 安捷倫（中國）公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 理化指標(biāo)測定

1.2.1.1 溫度的測定 在發(fā)酵池中用溫度計(jì)每天早晚各檢測一次，取平均值[27]。

1.2.1.2 pH 測定 取10 g 醋醅樣品加入30 mL 水中混勻后，用pH 計(jì)測定濾液pH[4]。

1.2.1.3 酸度測定 酸度的測定參照GB 5009.239-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測定。

1.2.1.4 還原糖測定 采用3,5-二硝基水楊酸鹽法[28]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：首先分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于帶刻度的試管中，用蒸餾水補(bǔ)足至1.0 mL，分別加入DNS 溶液2 mL，煮沸2 min，冷卻后用水補(bǔ)足至10 mL 刻度線，在540 nm 下測定吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品前處理：稱5 g 樣品加100 mL 水，浸泡30 min，過濾。

樣品測定：取上述濾液1 mL，加入DNS 溶液2 mL，煮沸2 min，冷卻后用水補(bǔ)足至10 mL 刻度線，在540 nm 下測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算還原糖含量，表示為（mg 葡萄糖/mL）。計(jì)算公式如下：

式中：X0為樣品中還原糖的含量（以葡萄糖計(jì)），mg/g；M0為稱取的樣品質(zhì)量，g；M0為由樣品液吸光度從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的葡萄糖濃度，mg/mL；100 為樣品中加入水的體積。

1.2.1.5 游離氨基氮測定 采用GB/T 5009.39-2003醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法中的甲醛滴定法。

樣品前處理：稱取5 g 樣品加100 mL 水，浸泡30 min，過濾。

吸取5.0 mL 上述樣品稀釋液，置于100 mL 容量瓶中，加水至刻度，混勻后吸取20.0 mL,置于200 mL燒杯中，加入60 mL 水，開動(dòng)磁力攪拌器，轉(zhuǎn)速為1000 r/min，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05 mol/L）滴定至pH8.2，記下消耗的氫氧化鈉體積。向其中加入甲醛溶液10.0 mL，混勻后，繼續(xù)滴定至pH9.2，記錄下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積。同時(shí)取80 mL水，先用氫氧化鈉溶液（0.05 mol/L）調(diào)節(jié)pH 為8.2，再加入10.0 mL 甲醛溶液，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.05 mol/L）滴定至pH9.2，同時(shí)做空白試驗(yàn)。計(jì)算公式如下：

式中：X 為樣品中氨基酸態(tài)氮的含量（以氨計(jì)），g/kg；V 為滴定樣品稀釋液消耗0.05 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V0為空白試樣消耗0.05 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V1為樣品稀釋液取用量，mL；c 為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol/L；0.014 為1.00 mL 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c（NaOH）=1.000 mol/L]相當(dāng)于氨的質(zhì)量，g。

1.2.2 乳酸和乙酸含量測定

1.2.2.1 樣品處理 稱取10 g 醋醅，加30 mL 超純水浸泡3 h，過濾后取濾液25 mL 并加入1 mL的亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）和1 mL的硫酸鋅（300 g/L）溶液，用超純水定容至100 mL，混勻后靜置1 h，取上清液過0.22 μm 濾膜，棄去初濾液，取續(xù)濾液供HPLC 分析用[29]。

1.2.2.2 高效液相色譜條件 色譜柱Venusil MP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：20 mmol/L NaH2PO4（pH2.7），比例為100%；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃；紫外檢測器波長：210 nm。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程 分別精確稱取乳酸和乙酸標(biāo)品10 mg 溶于10 mL 超純水中，混勻后作為母液，依次從母液中取0、2、4、6、8、10 mL，分別定容到10 mL，使得終濃度依次為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，在相同的色譜條件下進(jìn)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[30]。

1.2.2.4 定量方法 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間和出峰面積對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量分析。

1.2.3 乙醇含量測定

1.2.3.1 樣品處理 分別稱取醋醅固體樣品2 g 置于10 mL的頂空萃取瓶中，加入2.5 g NaCl 進(jìn)行飽和，同時(shí)加入15 μL（8.4×10?4mg/L）的2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)峰面積比對(duì)進(jìn)行定量；萃取瓶于50 ℃水浴預(yù)熱10 min，萃取針經(jīng)230 ℃老化處理30 min 后插入萃取瓶，保持50 ℃恒溫水浴條件下萃取40 min，之后將萃取針插入GC-MS 分析儀進(jìn)樣口，解析5 min，采集樣品數(shù)據(jù)[30]。

1.2.3.2 色譜條件 色譜柱DB-WAX（60 m×250 μm×0.25 μm）；載氣為高純He，流速1 mL/min,進(jìn)樣口溫度230 ℃；程序升溫：初始溫度35 ℃保持1 min，然后以5 ℃/min 升至130 ℃保持1 min，再以5 ℃/min升至150 ℃保持2 min，最后以8 ℃/min 升至230 ℃保持1 min，總共運(yùn)行時(shí)間為38 min。

1.2.3.3 質(zhì)譜條件 電子電離源（EI），70 eV 電子能量，采集模式為全掃描，質(zhì)量范圍20～550 u，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃。

1.2.4 總DNA 提取及擴(kuò)增

1.2.4.1 樣品預(yù)處理 取2 g 醋醅樣品于20 mL 10×PBS 緩沖液（pH7.4）中懸浮，在振蕩器上充分振蕩5 min，離心5 min（500×g，4 ℃）后收集上清液，將沉淀繼續(xù)用PBS 緩沖液洗滌兩次后收集上清液，將所有上清液再次離心10 min（12000×g，4 ℃），收集沉淀，用1 mL 10×PBS 緩沖液重懸沉淀轉(zhuǎn)入1.5 mL的PE 管中，?20 ℃保存[31]。

1.2.4.2 DNA 提取 根據(jù)Omega 試劑盒的使用說明書，對(duì)樣品進(jìn)行總DNA的提取，將獲得的總DNA 通過1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，同時(shí)采用紫外分光光度計(jì)對(duì)回收后的DNA 進(jìn)行定量。瓊脂糖凝膠電泳檢測參數(shù)如下：Marker 上樣量5 μL，樣品上樣量5 μL，電泳時(shí)間20 min，瓊脂糖濃度1.20%，電壓120 V，恒壓，電流約80 mA。

1.2.4.3 PCR 擴(kuò)增及測序 采用通用引物P1（ACTCC TACGGGAGGCAGCA）和P2（GGACTACHVGGGT WTCTAAT）對(duì)細(xì)菌16S rRNA 基因進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR 樣品均勻稀釋至20 ng/L，擴(kuò)增體系（25 μL）：5×reaction Buffer 5 μL,5×GC Buffer 5 μL,dNTP（2.5 mmol/L）2 μL,Forward primer（10 μmol/L）1 μL,Reverse primer（10 μmol/L）1 μL,DNA Template 2 μL，ddH2O 8.75 μL,Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。

擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s（30 次循環(huán)），最后72 ℃延伸10 min。隨后擴(kuò)增子送上海派森諾生物技術(shù)有限公司的Illumina MiSeq 平臺(tái)（Illumina,San Diego,CA,USA）上進(jìn)行測序[32?35]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http://qiime.org/）軟件，剔除疑問序列以及統(tǒng)計(jì)數(shù)，對(duì)所獲得的序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU 劃分，刪除豐度值小于0.001%的OTU，采用Silva 數(shù)據(jù)庫（Release132，http://www.arb-silva.de）[20]對(duì)OTU 進(jìn)行分類鑒定。然后利用R 軟件繪制帶有各種分類信息的柱狀圖，直觀比較不同樣本OTU 數(shù)量和分類狀態(tài)識(shí)別結(jié)果的差異。使用SPSS 軟件（SPSS 軟件，中國上海）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。使用ORIGIN（OriginLab）對(duì)曲線進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)分析

醋醅固態(tài)發(fā)酵周期是17 d，在整個(gè)發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的變化如圖3 所示，發(fā)酵初期溫度為27.4 ℃，結(jié)合理化指標(biāo)中溫度前三天的變化，推測出由于好氧微生物的生長繁殖，導(dǎo)致物料內(nèi)部的溫度迅速上升，在第3 d 時(shí)溫度迅速增長至38.2 ℃，此后溫度處于緩慢上升的趨勢，直至第9 d 溫度達(dá)到最高點(diǎn)44.4 ℃；之后隨著時(shí)間的延長，溫度處于緩慢下降的趨勢，這是由于好氧微生物的緩慢衰亡，厭氧微生物出現(xiàn)生長，因此溫度仍然處于37 ℃左右。

圖3 四川曬醋固態(tài)發(fā)酵過程中各理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化圖Fig.3 Dynamic changes of physicochemical indexes during the solid-state fermentation of Sichuan Sun vinegar

水分是保持微生物生長較重要的因素之一，發(fā)酵前三天由于微生物的生長消耗了大量的物料，產(chǎn)生的熱量使得物料內(nèi)部的水分蒸發(fā)，因此水分含量急劇下降；隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物代謝產(chǎn)生的氣體使得物料內(nèi)部的水分含量有所增加，使得水分含量出現(xiàn)增加。整個(gè)發(fā)酵過程中，水分含量保持在49.2%～58.3%之間波動(dòng)。

由于發(fā)酵過程中酸物質(zhì)的積累（發(fā)酵前7 d 酸度一直處于上升的趨勢），使得發(fā)酵pH 在第1～7 d 急劇下降，之后趨于平緩（基本維持在pH3.9 左右）直到發(fā)酵結(jié)束；酸度在第7～11 d 略有小幅下降，推測是在這個(gè)階段，物料中的酸性物質(zhì)被微生物繼續(xù)利用，使得酸物質(zhì)減少。

發(fā)酵第1～3 d，還原糖含量急劇上升，到第5 d急劇下降，然后呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，這可能是由于曬醋的發(fā)酵過程與糖化、酒化、醋化同時(shí)進(jìn)行，糖化主要處于整個(gè)醋酸發(fā)酵的初始階段，在第3 d 后，在還原糖充足的情況下，微生物開始大量利用還原糖進(jìn)行發(fā)酵。在整個(gè)發(fā)酵過程中，氨基酸氮的含量始終呈上升趨勢，這與發(fā)酵液中產(chǎn)生蛋白酶的微生物密切相關(guān)，而蛋白質(zhì)在蛋白酶作用后產(chǎn)生氨基酸等含氮物質(zhì)。

2.2 醋醅發(fā)酵過程中乙酸、乳酸和乙醇的變化情況

從圖4 分析可知，發(fā)酵的前7 d，乳酸和乙酸的含量都在明顯升高，這一現(xiàn)象也與圖3 中酸度升高，pH 下降的變化相吻合。同時(shí)，乳酸的含量要高于乙酸，說明發(fā)酵前期乳酸發(fā)酵占主導(dǎo)地位，使得乳酸含量較高；到第11 d 時(shí)乳酸被微生物利用使得含量下降。在第9 d 時(shí)乙醇含量達(dá)到最大值，隨后出現(xiàn)下降趨勢，表明乙醇開始大量被轉(zhuǎn)化為乙酸，發(fā)酵開始逐漸步入以醋酸發(fā)酵為主的發(fā)酵階段，此時(shí)乙酸含量又出現(xiàn)上升。由于曬醋的發(fā)酵過程同時(shí)包含糖化、酒化和醋化，因此當(dāng)發(fā)酵結(jié)束時(shí)（第17 d）乙酸含量（16475.10±670.31）mg/100 g 和乳酸（14895.64±717.30）mg/100 g 含量出現(xiàn)了相差不大的情況。

圖4 四川曬醋固態(tài)發(fā)酵過程中乙酸、乳酸和乙醇含量的動(dòng)態(tài)變化圖Fig.4 Dynamic changes of acetic acid,lactic acid and ethanol contents during the solid-state fermentation of Sichuan Sun vinegar

2.3 高通量測序結(jié)果分析

2.3.1 DNA的提取和擴(kuò)增 醋醅樣本的DNA 擴(kuò)增后電泳圖如圖5 所示，9 個(gè)樣品的9 條序列均有明顯的條帶出現(xiàn)，說明DNA 擴(kuò)增成功，可以進(jìn)入測序平臺(tái)進(jìn)行測序。

圖5 DNA的擴(kuò)增電泳圖Fig.5 Amplification electrophoresis image of DNA

2.3.2 醋醅微生物群落測序深度評(píng)價(jià)及測序分析稀釋曲線（Rarefaction curve）主要利用各醋醅在不同測序深度時(shí)的微生物Alpha 多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各醋醅在不同測序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。它可以用來比較測序數(shù)據(jù)量不同額醋醅中物種的豐富度、均一性或多樣性，也可以用來說明醋醅的測序數(shù)據(jù)量是否合理。如圖6 所示，隨著測序深度的增加，OTU 數(shù)量呈上升趨勢，直至趨于平緩。但第13 d的稀釋曲線并沒有接近飽和，說明如果測序深度繼續(xù)增加，可以發(fā)現(xiàn)新的OTU，但上升范圍逐漸穩(wěn)定，從測序量可以看出本次測序已滿足所需要的測序深度，測序量基本合理。

圖6 四川曬醋固態(tài)發(fā)酵過程中細(xì)菌稀釋曲線Fig.6 Bacterial rarefaction curve during the solidstatefermentation of Sichuan Sun vinegar

從表1 可以看出，本次測序共獲得344233 條序列，序列的平均長度為394 bp，能夠覆蓋16S rDNA V3～V4 區(qū)域；在發(fā)酵的過程中結(jié)合五個(gè)分界來看，細(xì)菌的OTU 在發(fā)酵初期（1～3 d）略微減少，這可能是一些細(xì)菌進(jìn)入發(fā)酵狀態(tài)還沒有適應(yīng)環(huán)境，表現(xiàn)出下降的趨勢。第3～7 d 細(xì)菌OTU 開始上升，達(dá)到高峰，第7～11 d 發(fā)酵過程中細(xì)菌OTU 總量略微下降，但差異較小。第11～15 d 細(xì)菌OTU 數(shù)量明顯減少，這也證實(shí)了因酸度上升導(dǎo)致微生物減少的結(jié)果。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間樣品的測序量以及測序分類地位劃分Table 1 Sequencing quantity of samples with different fermentation time and classification of sequencing status

2.3.3 醋醅發(fā)酵過程中微生物群落的α-多樣性分析對(duì)于微生物群落來說，有多種指標(biāo)可以反映其多樣性，其中多樣性指數(shù)包括Chao 1 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)等。Chao 1 或ACE指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高；Shannon 指數(shù)綜合考慮了群落的豐富度和均勻度，且主要針對(duì)優(yōu)勢菌群；Simpson 指數(shù)對(duì)均勻度和群落中的優(yōu)勢OTU 更敏感；Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高。

從表2 可以看出，在整個(gè)發(fā)酵的17 d 中，Chao 1 指數(shù)在651.38～1119 之間波動(dòng)變化，發(fā)酵的初始階段，來自于醋曲和原料中的微生物不能較好的適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，使得微生物生長出現(xiàn)了一個(gè)短暫的停滯，使得豐富度下降，因此P3的豐富度小于P1 豐富度；當(dāng)微生物適應(yīng)環(huán)境后，出現(xiàn)迅速的增長，因此從第3～7 d，樣本豐富度上升并達(dá)到最大值1119，之后豐富度趨于平穩(wěn)；在發(fā)酵的后期，由于酸物質(zhì)的累積，環(huán)境中pH 下降，使得微生物生長受到抑制甚至是衰亡，導(dǎo)致第15～17 d 樣本的豐富度顯著下降。Shannon 指數(shù)在4.59～6.74 之間波動(dòng)，出現(xiàn)先增加后下降的變化趨勢，與Chao 1 指數(shù)不同之處在于發(fā)酵第3 d的多樣性要高于第1 d，說明發(fā)酵初期，由原料、環(huán)境中帶入了微生物，使得多樣性出現(xiàn)了增加。在第7～9 d，由于乙酸和乙醇含量在繼續(xù)上升（圖4所示），使得環(huán)境中的微生物生長受到影響，進(jìn)而微生物群落的多樣性和豐富度也有所下降。Simpson 指數(shù)在整個(gè)發(fā)酵過程中沒有出現(xiàn)大幅變化，說明微生物群落中優(yōu)勢菌群的均勻度沒有太大變化。

表2 基于擴(kuò)增子測序的微生物多樣性指數(shù)Table 2 Microbial diversity index based on amplicon sequencing

2.3.4 分類學(xué)組成分析 由圖7 可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中，第15 d 發(fā)酵的細(xì)菌各分類水平歸屬于11 個(gè)門、14 個(gè)綱、36 個(gè)目、45 個(gè)科、79 個(gè)屬，為所有樣本中最高的，而第3 d 樣本的細(xì)菌各分類水平類群數(shù)則為最低的。

圖7 各分類水平的微生物類群數(shù)統(tǒng)計(jì)圖Fig.7 Statistical diagram of microorganism groups at different taxonomic levels

在發(fā)酵第1～3 d的微生物類群處于下降階段，第3～7 d 微生物類群處于上升，第7～9 d 處于下降，然后第9～15 d 又繼續(xù)上升，第15～17 d 微生物類群又開始下降。結(jié)合前面理化指標(biāo)、酸變化趨勢，推測產(chǎn)生這種結(jié)果的原因如下：a.第1 d的醋醅中含有來自于醋曲和原料帶入的微生物，使得微生物類群有較高的水平，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，當(dāng)中的部分微生物生長受到環(huán)境因素的改變，出現(xiàn)了短期的延滯，因此第3 d 微生物類群水平下降；b.隨著微生物適應(yīng)了發(fā)酵環(huán)境，微生物的生長處于快速增長時(shí)期，從第3～7 d，微生物類群又出現(xiàn)了增加的趨勢；c.在發(fā)酵的第7～9 d，隨著發(fā)酵環(huán)境中的乙酸、乳酸含量升高，微生物類群出現(xiàn)小幅下降的變化；d.隨著第9～15 d 乙醇含量的降低，乙酸含量的增加，有利于酸性微生物的生長，因此微生物類群又開始上升；e.第15～17 d 微生物類群緩慢下降，有可能是進(jìn)入后期，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，酸性物質(zhì)的累積，促使微生物類群減少。

由圖8 可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中，厚壁菌門（Firmicutes）在發(fā)酵前期占主導(dǎo)，相對(duì)豐度為53.1%，為發(fā)酵前期的優(yōu)勢菌群，隨著時(shí)間的延長，呈逐漸下降的趨勢；變形菌門（Proteobacteria）在發(fā)酵后期占主導(dǎo)，相對(duì)豐度為44.1%，為發(fā)酵后期的優(yōu)勢菌群，并隨時(shí)間的延長而逐漸增加。

圖8 微生物門水平上組成和豐度分布Fig.8 Microbial composition and abundance distribution

由圖9 可知，發(fā)酵的第1 d，主要微生物群落為乳桿菌屬（Lactobacillus），魏斯氏菌屬（Weissella）和頂生雀麥菌屬（Bromus_tecrorum）分別占36.8%、32.7%和14.5%，當(dāng)中的乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和魏斯氏菌屬（Weissella）主要來源于醋曲，頂生雀麥菌屬可能來源于發(fā)酵原料及周邊環(huán)境；由豐度顯示，在發(fā)酵第1 d 后頂生雀麥菌屬（Bromus_tecrorum）逐漸下降到零，可推測該菌屬并非是曬醋發(fā)酵過程中的主導(dǎo)菌屬。

圖9 微生物屬水平上組成和豐度分布Fig.9 Microbial composition and abundance distribution

發(fā)酵第1～3 d，乳桿菌屬（Lactobacillus）豐度上升至峰值，占比高達(dá)91.5%，其次還有少量的魏斯氏菌屬（Weissella），占4.1%；發(fā)酵第3～7 d，雖然乳桿菌屬（Lactobacillus）仍是主導(dǎo)菌屬，但豐度有所下降。與此同時(shí)，醋桿菌屬（Acetobacter）出現(xiàn)增長的趨勢；發(fā)酵第7～9 d，乳桿菌屬（Lactobacillus）逐漸增加，使得發(fā)酵過程中酸物質(zhì)的積累；發(fā)酵第9～17 d 乳酸菌屬（Lactobacillus）呈逐漸下降的趨勢，最終相對(duì)豐度占2.3%。醋桿菌屬（Acetobacter）呈上升的趨勢，最終相對(duì)豐度占66.5%。由于前3 d 屬于發(fā)酵前期，溫度尚未達(dá)到發(fā)酵溫度，且沒有進(jìn)行翻醅，氧氣的供給量相對(duì)較少，故乳桿菌屬呈現(xiàn)大量生長的勢頭；而醋桿菌屬因氧氣供應(yīng)不足導(dǎo)致生長緩慢；隨著醋醅發(fā)酵溫度上升，為了保證發(fā)酵的正常進(jìn)行需進(jìn)行翻醅降溫，此時(shí)供氧量增大，促使醋酸桿菌大量生長，而部分厭氧菌則因此衰亡，最終醋桿菌屬成為主導(dǎo)菌屬。

除此之外，在曬醋微生物群落分類中還發(fā)現(xiàn)了少量的貪銅菌屬（Cupriavidus）、嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas），相對(duì)豐度分別占11.8%、8.0%和3.7%。在第13 d、第15 d 和第17 d，這三類菌的占比總和相對(duì)豐度分別為46.9%、60.6%和23.5%。

2.3.5 聚類分析 系統(tǒng)聚類法的基本思路是將多個(gè)樣品各自作為一類，然后計(jì)算各類之間距離的遠(yuǎn)近，首先將距離最近的兩類合并成新的一類，然后用所得到的新一類和其他類樣品再進(jìn)行距離分析，將此時(shí)距離最近的再歸為一類，直至將所有樣品合為一大類，最終形成聚類樹狀圖[21?22]將測序結(jié)果通過非加權(quán)組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）進(jìn)行計(jì)算，以等級(jí)樹的形式展示樣本間的相似度，如圖10 所示。

圖10 基于Weighted UniFrac 距離矩陣的UPGMA 聚類分析圖Fig.10 UPGMA cluster analysis diagram based on Weighted Unifrac distance matrix

從圖10 可以發(fā)現(xiàn)，整個(gè)發(fā)酵過程中的17 個(gè)樣品中，第15～17 d 和第13 d 可以優(yōu)先聚為一類，提示其菌落群落特征最大程度區(qū)別于其他幾個(gè)類別的樣品，這與前面分類學(xué)水平分析的結(jié)果相一致；其次是第5～11 d 可以聚為一類，其中第7～9 d 與第11 d 又繼續(xù)聚為一類，這與前面的研究結(jié)果也相對(duì)應(yīng)；最后是第1～3 d 聚為一類。這提示了曬醋發(fā)酵過程中菌落群落的差異，反映了各樣品之間的親緣關(guān)系強(qiáng)弱，為進(jìn)一步揭示曬醋的發(fā)酵代謝機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

本研究采用高通量測序分析四川曬醋固態(tài)發(fā)酵階段細(xì)菌群落變化情況，通過醋醅動(dòng)態(tài)理化指標(biāo)、細(xì)菌群落的分類學(xué)組成的變化和聚類分析表明，乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋桿菌屬（Acetobacter）為發(fā)酵過程的主要優(yōu)勢菌屬，并初步劃分了“三邊同池”的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，推測出發(fā)酵第1～3 d 是發(fā)酵前期；發(fā)酵第5～11 d 是發(fā)酵中期；發(fā)酵第13～17 d 是發(fā)酵后期。

此外，通過研究發(fā)現(xiàn)曬醋發(fā)酵后期除了醋桿菌屬（Acetobacter）為優(yōu)勢菌屬外，還有其他優(yōu)勢菌屬，為貪銅菌屬（Cupriavidus）、嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas），這些菌屬在其他食醋中的相關(guān)報(bào)道較少，這表明微生物多樣性與發(fā)酵原料、發(fā)酵工藝、地理位置、發(fā)酵環(huán)境有很大的關(guān)系。

本研究的發(fā)現(xiàn)為食醋功能成分與微生物菌群的聯(lián)系奠定了基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步了解四川曬醋釀造和提高食醋的品質(zhì)與安全具有重要意義。