蔣明莉，黃義峰，吳金花(貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院，貴州 貴陽 550014)

1 概述

隨著生活水平的提高，染發(fā)越來越普遍，且每個人的染發(fā)頻次越來越高[1-2]。染料中間體主要成分多為苯胺類化合物，使用后可能引起許多不良反應[3-5]。自1999年衛(wèi)生部發(fā)布我國第一部《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》以來，到2007年7月1日衛(wèi)生部頒布實施的《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》(2007年版)，再到2016年12月1日國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布實施的《化妝品安全技術規(guī)范》(2015年版)，均規(guī)范列出了染發(fā)類化妝品中允許使用的染發(fā)劑原料，并明確了它們的限制使用要求和標簽標注規(guī)定。染發(fā)產(chǎn)品的安全性極為重要，染發(fā)時染發(fā)劑或多或少會接觸到皮膚上，染發(fā)劑中的著色劑對苯二胺等作為致癌的有毒物質(zhì)，雖然含量未超過國家的限制標準，依然會對人體造成傷害，長期使用染發(fā)劑染發(fā)將會嚴重的損害人體健康。因此，染發(fā)劑中對苯二胺等物質(zhì)的分離檢測，對于消費者選擇和使用染發(fā)劑具有非常實際的意義。

高效液相色譜法是目前最理想的檢測染料中對苯二胺等物質(zhì)的方法。目前在實驗室進行檢測時，發(fā)現(xiàn)有的標準文本中提供的實驗條件往往在實驗室實際情況下無法復原標準文本中的結果，有的標準文本提到的部分實驗內(nèi)容比較晦澀讓人很難理解到位。在這些情況下按照標準文本檢測不出目標物質(zhì)時，如何通過改變色譜條件來完成定性定量檢測是本文的主要研究目的。本實驗通過《化妝品安全技術規(guī)范》(2015版)中染發(fā)劑檢驗方法對對苯二胺等8種組分進行檢測[6]，來尋找和確定最佳色譜條件并完成檢測，為各實驗室在新的標準擴項及日常檢測中提供一定的參考。

2 實驗

2.1 色譜柱的選擇

從化妝品安全技術規(guī)范2015版的檢測方法中，推薦的色譜柱為 C18(250 mm×4.6 mm×10 μm)，流速 2.0 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫：20 ℃；采用規(guī)范中推薦的色譜條件檢測對苯二胺等8種組分所得的譜圖如圖1所示。

圖1 按照標準文本的條件所得對苯二胺等8種組分色譜圖

從圖1可以看出對苯二胺的峰形寬且分裂，甲苯2,5-二胺與氫醌在同一保留時間出峰無法分離。通過降低流速和柱溫等條件也無法改善對苯二胺的峰形以及使甲苯2,5-二胺與氫醌有效分離。因此考慮更換內(nèi)徑小及填充粒徑小的色譜柱，以提高分離效果。通過實驗，C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)和C18(150 mm×3.5 mm×2.1 μm)等色譜柱填充粒徑變小或內(nèi)徑減小的色譜柱均可以達到分離的效果。本文選用了C18(150 mm×3.5 mm×2.1 μm)色譜柱進行研究，得到如圖2所示的色譜圖。

從圖2可以看出，8種物質(zhì)都分離了，可是對苯二胺的峰仍然寬且分裂。雖然根據(jù)該色譜條件建立的8種物質(zhì)濃度梯度的校正曲線的相關系數(shù)均達0.999，但是對苯二胺峰形太差，仍然需要進一步實驗研究。

圖2 改變色譜柱所得對苯二胺等8種組分色譜圖

2.2 溶劑的選擇

一般情況下，在高相液相色譜實驗時，為避免所用溶劑與流動相的差異大，制備標準溶液的溶劑與液相的流動相基本是一致的。本標準文本中制備標液溶劑為：95%的乙醇，而流動相則為：含5%乙腈的磷酸緩沖溶液。采用規(guī)范中推薦的流動相進行試驗，發(fā)現(xiàn)所檢測的標準物質(zhì)對苯二胺的峰分裂嚴重，峰形很不好如圖2所示。通過試驗，我們用流動相的溶液作為溶劑來配制標準溶液能夠解決這個問題，檢測的色譜圖如圖3所示。

從圖3可以看出，使用流動相的溶液配制標準溶液，可以很好地改善對苯二胺峰形不好的問題。從圖3可以看出鄰苯二胺和間苯二胺的分離不好，可以通過改變流速來提高分離度。

圖3 改變?nèi)軇┧脤Ρ蕉返?種組分的色譜圖

2.3 流速的選擇

通常，降低流速可以提高分離度，但是檢測時間會變長，提高流速可以節(jié)約分析時間，但是分離度會有所降低，把流速從2.0 mL/min調(diào)至1.0 mL/min，得到如圖4所示的色譜圖。

從圖4可以看出，對苯二胺等8種組分完成了有效分離檢測，且每種組分配制的標準系列的線性范圍＞0.999，用此色譜條件可以很好地完成染發(fā)類化妝品中對苯二胺等組分含量的檢測。

圖4 改變流速所得色譜圖

同時我們應該明白，降低流速并不能把原本無法分離的物質(zhì)進行分離，而只是把分離度欠佳的物質(zhì)進行更好地分離。對于完全無法分離的情況，筆者建議首先改變色譜柱再進行條件探索。在色譜分析中，分離度、分析速度和柱容量三者之間的關系，呈現(xiàn)幻想的三角形，即其中任一因素都要受到另外兩個因素的制約，要平衡三者去實現(xiàn)最佳參數(shù)的選擇。

2.4 流動相pH的調(diào)節(jié)

本人在實驗過程中發(fā)現(xiàn)流動相的pH對各組分分離有巨大的影響。在規(guī)范中提到，流動相的pH調(diào)至7.7，是弱堿性，那么若調(diào)節(jié)的pH無法剛好為7.7時，調(diào)至7.7以下與7.7以上是否有區(qū)別呢？以上實驗色譜圖均是pH調(diào)節(jié)至7.7稍稍偏上所得的結果，而將流動相pH調(diào)節(jié)至7.7以下時且用該流動相作為溶劑配制混合標準溶液時得到的色譜圖如圖5所示。

從圖5可以看出，對苯二胺和對氨基苯酚幾乎同時出峰，不能有效分離。因此，流動相的pH對檢測結果影響很大，并非調(diào)節(jié)成7.7左右這么籠統(tǒng)而已。在實際分析時，要注意調(diào)節(jié)的流動相pH對實驗結果的影響，避免在實驗過程中走彎路。

圖5 pH的調(diào)節(jié)至7.7以下所得色譜圖

3 結語

根據(jù)以上實驗研究，確定檢測染發(fā)劑中對苯二胺的檢測最佳參考色譜條件為：色譜柱：C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)、C18柱(150 mm×3.5 mm×2.1 μm)及等效色譜柱。流動相pH：調(diào)至7.7或偏高一點，標準溶液稀釋溶劑：與流動相保持一致，流速：1.0 mL/min。使用本文的檢測條件能夠很好的檢測染發(fā)劑中對苯二胺等物質(zhì)，檢測的每一種標準物質(zhì)的線性均在0.999以上，檢出限、定量限等滿足《化妝品安全技術規(guī)范》2015版中檢驗方法的要求，在檢測實際染發(fā)劑產(chǎn)品時結果精密度和回收率均滿足GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》標準的要求，用以上色譜條件可以得到較好的實驗效果。

高效液相色譜法不僅僅是檢測染發(fā)劑中各組分的最佳方法，同時也是許多物質(zhì)檢測的常規(guī)方法，該方法已成為化學、醫(yī)學、工業(yè)、農(nóng)學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術；在使用高效液相色譜法時如何尋找最佳色譜條件，是每一位檢測者必須面對的第一課題。本文通過染發(fā)劑中對苯二胺等物質(zhì)檢測條件的優(yōu)化為例，介紹了在使用高效液相色譜法檢測時遇到問題時的解決思路，不僅為初學者也為普通檢測人員在日常檢測和新方法開發(fā)時提供一定的參考思路。